I. 서 론
Covid-19으로 인한 팬데믹으로 전세계가 이제까지 경험하 지 못한 새로운 뉴노말 시대로 전환되면서 많은 변화를 겪 고 있다. 이러한 시기에 무엇보다 건강이 최고의 관심사가 되면서 질병 예방과 건강유지를 위한 항산화 및 항암작용의 식재료 성분에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.
게르마늄은 생리적으로 면역증강, 항산화, 항암활성 등의 약리효과가 있는 것으로 알려져 왔으며, 게르마늄의 의학적 효능이 처음 알려진 것은 1930년 프랑스와 스페인 국경지방 인 Lourdes의 샘물이 함유하고 있는 게르마늄 성분이 암을 비롯한 여러 가지의 질병 치료에 큰 효과가 있다고 밝혀지 면서 부터이다. 게르마늄(Germanium dioxide, GeO2)은 원소 기호 Ge, 원자번호 32, 원자량 72.61, 비중 7-8인 아금속 반 도체 물질로 1886년 독일의 화학자 Clemen Winkler가 최초 로 발견하였고, 자연계에는 동식물, 흙, 암석 등에 분포되어 있으며, 산업적으로는 전자산업, 의료용품, 섬유, 식품 등의 분야에서 유용물질로 활용되고 있다(Lee et al. 2004). 자연 계에 분포 하고 있는 게르마늄은 산소, 염소, 암모니아 등과 결합한 무기 게르마늄과 탄소와 결합되어 있는 유기 게르마 늄으로 분류할 수 있다. 유기 게르마늄에는 무기 게르마늄을 효소로 발효시킨 생합성 유기 게르마늄(Wei 1992)이 있고, 산삼, 인삼, 마늘 등 식물체가 토양중의 무기 게르마늄을 흡 수하여 생체에 함유시킨 천연 유기게르마늄(Chang & Oh 2005)과 일본에서 발명한 Ge-132를 포함하여 약 100 여종의 화학합성 유기 게르마늄이 있다(Sugiya et al. 1986). 무기 게르마늄인 GeO2는 장기 복용시 빈혈, 신장 기능장애, 근육 장애, 신경병증 등을 유발(Iijima et al. 1990;Obra et al. 1991)하는 반면에 유기 게르마늄은 항종양 효과(Ikemoto 1996), 항돌연변이 효과(Mochizuki & Kada 1982;Jang et al. 1991), 면역 강화작용(Suzuki et al. 1986)과 바이러스 감 염의 치료효과(Aso et al. 1985), 해열 진통작용(Suzuki & Taguchi 1983), 중금속 배출작용(Lee & Chung 1991) 및 운동성 증가(Ho et al. 1990) 등의 다양한 약리작용을 가지 고 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 식물중에 함유되어있는 유기 게르마늄은 체내에 잔류하지 않고 약리작용을 하기 때문에 천연 유기 게르마늄 형태인 식품으로 섭취하는 것이 체내에 서 보다 안전하다(Gerber & Leonard 1997). 몇몇 연구자들 은 유기 게르마늄을 함유하는 기능성 농산물을 개발하기 위 하여 무기 게르마늄을 비료로 사용하여 재배한 미나리(Lee et al. 2008), 벼(Seo et al. 2010) 등을 이용하였고, 천연의 게르마늄 원천수(게르마늄 함량: 18.3 ppb)와 농축한 게르마 늄수 (게르마늄 함량: 51.8 ppb)로 미나리, 상추 등을 재배 하였다(Lee 2016).
본 연구는 국민의 질병 예방과 건강에 도움을 주는 식생 활문화에 기여하고자 하는 목적으로 이온화 기기를 사용하 여 고함량 게르마늄 농축수를 제작(게르마늄 함량: 1,683 ppm)하고, 이 농축수를 다량 희석하여 재배한 농산물들에서 게르마늄의 함량 분석과 효능 분석을 함으로써 고농도 유기 게르마늄 함유 농산물의 항염 및 항암 효과를 확인하고 웰 니스 보조식품 신소재로 개발하고자 한다.
II. 연구 내용 및 방법
1. 게르마늄 농축수 제작
수돗물 100 L에 순도 99.9999%의 게르마늄 1 kg을 넣어 이온화 기기<Figure 1>에 연결한후 10일 동안 전기분해 공 법으로 게르마늄 농축수를 제작하였다.
2. 게르마늄 농축수에 의한 농산물 재배 및 시료 준비
청산영농조합법인에서 쥐눈이콩(Mouse-eyed bean), 인삼 (Ginseng) 씨앗, 들깨(Perilla) 씨앗, 브로콜리(Broccoli) 씨앗, 상추(Lettuce) 씨앗을 22-25°C, 습도 60-70%에서 10 ppm의 게르마늄 농축수로 10일간 수경재배 한 것을 건조시킨 후 분 쇄한 분말을 제공 받아서 70% ethanol 추출하여 시료를 준 비 하였다.
3. 게르마늄 함량 분석
게르마늄 농축수를 사용하여 재배한 농산물의 건조분말은 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 게르마늄의 함량을 분 석하였다. 쥐눈이콩나물(A)에서 210.9 ppm, 인삼새싹(B) 에 서 92.6 ppm, 들깨 새싹(C)에서 12.5 ppm, 브로콜리 새싹(D) 에서 82.2 ppm, 상추 새싹(E) 에서 11.7 ppm의 게르마늄이 각각 검출되었다<Table 1>.
4. 세포 배양
전립선 암세포주, PC-3는 한국생명공학연구원에서, 대식세 포인 Raw264.7은 한국 세포주은행(KCLB; seoul, Korea)에 서 분양 받은 것을 사용하였다. 전립선 암세포주, PC-3는 RPMI-1640, Raw264.7은 DMEM배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 units/mL의 Penicillin-streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 넣어 37°C의 5% 항온기에서 배양하였다.
5. MTT assay
PC-3세포를 3×105개씩 세어서 100 mm culture dish에 넣 고 쥐눈이 콩나물(A), 인삼 새싹(B), 들깨 새싹(C), 브로콜리 새싹(D), 상추 새싹(E) 추출물 각각 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0 μg/μL의 농도로 처리한 후 96 well에서 MTT용액 (0.5%, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5diphenyl-2H-tetrazoli um bromide 액)을 각 well에 20 μL씩 넣고, 37°C, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 2,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음, 각 well당 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 150 μL 첨가 하여 30분 동 안 교반한 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm의 흡광도를 측정하였다.
6. 항산화 활성 분석
DPPH radical 소거 활성에 사용된 DPPH (1,1-Diphenyl- 2-icrylhydrazyl)와 DMSO (Dime thyl sulfoxide)는 Sigma 에서 구입하였다. DPPH용액(0.1 mM, ethanol)을 900 μL, DMSO를 50 μL, 각 각의 분말 추출물 50 μL를 첨가하여 실 온에서 20분 동안 반응시킨 후 ethanol에 의해 생긴 불순물 은 10,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 제거한 후 spectrophotometer를 통해 517 nm에서 흡광도를 측정 하여 DPPH radical 소거 활성을 확인하였다.
7. Western blot analysis
Raw264.7 세포를 1*E6개씩 세어서 TC-dish에 넣고 24시 간 배양한 후에 각 실험군의 시료를 100 μg/mL씩 24시간 동 안 처리하였다. RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출 한 다음 BCA assay로 정량하고 추출한 단백질 각 20 μg씩 well에 loading하여 running한 후 nitrocellulose membrane 에 transfer하였다. 1% BCA로 15분간 Blocking한 다음 membrane에 NLRP3, IL1-β, β-actin 1차 항체(1:1,000)를 넣고 4°C에서 overnight 하였다. 2차 항체(anti-rabbit)를 1시 간동안 처리한 후 LAS-4000으로 밴드를 관찰하고, Image-J 로 밴드의 intensity를 측정하였다.
8. 통계처리
모든 실험은 3회 반복 시행하였다. 각 실험군간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA (one way analysis of varience test)로 실시하고, Duncan’s multiple range test 를 이용하여 p<0.05일 경우에 유의한것으로 판정하였다 (SPSSV12, SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
III. 결과 및 고찰
1. 게르마늄 함유 농산물의 항산화 효과
여러가지 다양한 식물 영양소들에서 항산화 기능을 밝힘 으로서 건강 식품 및 식품 신소재로 개발하고자 하는 연구 들이 활발히 진행되어왔다(Kim et al. 2003;Kim et al. 2006;Jeong 2008). 특히 새싹채소의 기능성에 대한 관심이 증가하면서 새싹채소류에 대한 소비량이 증가하고, 이용도도 다양하게 증가하고 있다(Kim et al. 2013).
DPPH radical 소거능으로 항산화 활성을 분석한 결과 농 산물 A, B, C, D, E 모두 10 mg/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의적으로 DPPH radical을 소거하였으며(p<0.05), 낮은 농도에서 다소 차이를 보였지만 100 mg/mL의 농도에 서는 각각 87.6%±0.45, 89.5%±0.33, 81.3%±1.67, 85.1%±0.98, 79.6%±2.01의 DPPH 소거율을 나타내어 높은 항산화 활성 을 확인하였다. 상추 새싹은 게르마늄 함량이 상대적으로 낮 음에도 불구하고 50 mg/mL의 농도 (52.7%±1.05)부터 비교 적 높은 DPPH 소거능을 나타내었다<Figure 3>. 100 mg/ mL에서 확인한 DPPH소거능은 B, A, D, C, E 순서로 실험 군 모두 높은 소거능을 보였으며, 이러한 항산화 활성은 대 체적으로 식물에서 검출된 게르마늄의 함량에 비례하였다. 일반 수돗물로 재배한 쥐눈이 콩나물, 들깨 새싹, 상추 새싹 에서는 게르마늄이 불검출되었고, 인삼 새싹에서는 0.2 ppm, 브로콜리 새싹에서는 0.1 ppm의 게르마늄이 검출되었으며, 이들 중에서 수돗물로 재배한 상추와 들깨 새싹의 항산화 효 과를 게르마늄 농축수로 재배한 것과 비교한 결과 게르마늄 함량이 높은 상추(12.5 ppm)와 들깨 새싹(11.7 ppm)의 항산 화 효과가 100 mg/mL의 농도에서 3배 이상 높은 것을 확인 한 바 있다.
Kim et al. (2013)은 브로콜리 새싹 재배의 광원과 수확 후 가공조건에 따른 브로콜리 영양소 및 항산화 활성 특성 이 달라짐을 보고하였다(Kim et al. 2013).
이상과 같은 결과로 미루어, 영양성분의 종류와 양이 모두 다른 농산물이지만, 게르마늄수로 재배한 농산물이 보유하고 있는 고농도의 유기 게르마늄은 항산화작용을 활성화 시키 는데 도움을 주는 유용한 소재가 될 것으로 사료된다.
2. 전립선 암세포주(PC-3)에서 게르마늄 함유 농산물의 세포 증식 억제 효과
암과 같은 난치성 질환을 가진 환자를 치료하기 위한 약 물 중 절반 정도가 천연물로부터 유래되었을 정도로 이미 자 연 속 천연물들은 인류에 의해 광범위하게 활용되고 있다 (Clardy & Walsh 2004; . Newman & Cragg 2012). 고농 도 게르마늄을 함유하고 있는 천연물의 항암 활성을 확인하 기 위하여 사람의 전립선 암세포 주인 PC-3에 쥐눈이 콩나 물(A), 인삼 새싹(B), 들깨 새싹(C), 브로콜리 새싹(D), 상추 새싹(E) 추출물을 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0 μg/μL 농도로 24시간 투여하여 세포의 성장률을 분석하였다. A-E 실험군 모두 농도에 의존하여 세포의 성장이 현저히 억제되었으며, 이중에서 특히 B는 10 μg/μL의 저농도에서 24시간 투여하였 을 때 100% 세포 사멸의 효과를 나타내었고, D는 20 μg/μL 의 농도에서 암세포의 성장을 100% 억제하여 강력한 항암 활성을 보여주었다(p<0.001)<Figure 2>.
저자는 이전 연구(Lee 2016)에서 천연 게르마늄 원천수 (Ge: 18.3 ppb)와 이를 농축한 농축수(Ge: 51.8 ppb)를 이용 하여 게르마늄을 함유하고 있는 토양에서 재배한 미나리와 상추의 게르마늄 함량을 분석하고, 게르마늄 함량에 따른 생 리활성 효과를 관찰한 결과 천연 게르마늄 원천수로 재배한 미나리(7.96 ppb), 상추(5.6 ppb)보다는 농축수로 재배한 미나 리(99.8 ppb), 상추(76.9 ppb)의 게르마늄 함량이 더 높게 나 타났고, 항산화 및 항암 효과 역시 게르마늄 함량에 비례하 여 농도의존적으로 높게 나타난 것을 보고한 바 있다.
이전 연구(Lee 2016)에서 사용한 게르마늄수는 너무 농도 가 낮아 다량의 게르마늄 수를 공급할 수 없는 어려움이 있 었으나, 이번 연구에서 사용한 게르마늄수는 이와는 달리 이 온화 기기를 사용한 새로운 방식으로 고농도의 게르마늄수 를 제작하는데(Ge: 1,683 ppm) 성공하여 실제로 농산물 재 배에 필요한 많은 양의 게르마늄수를 생산할 수 있게 되었 다. 본 연구에서는 고농도 게르마늄수를 최종농도 10 ppm으 로 희석하여 농산물을 재배한 결과, 이전에 보고한 게르마늄 함유 농산물보다 매우 높은 농도의 게르마늄이 검출 되었고 <Table 1>, 게르마늄이 많이 검출된 순서는 A, B, D, C, E 였으며 항암활성이 높게 나타난 순서는 B, D, A, C, E로 게 르마늄의 함량에 비례하지는 않은 것으로 나타났다.
Kim et al. (2004)은 게르마늄 암석 분말을 첨가한 물을 사용하여 재배한 콩나물 즙액이 일반 콩나물에 비하여 위암 세포의 성장 억제 효과를 강하게 나타내었으며(Kim et al. 2004), 이러한 것은 게르마늄을 비롯하여 무기질, dietary fiber, vitamin C, phenolics 등의 여러 기능성 활성 물질의 함량이 일반 콩나물에 비하여 높기 때문으로 (Kim et al. 2002) 사료된다고 보고하였다.
Hur et al. (2020)은 10년 동안 숙성한 간장을 폐암, 간암, 림프암 세포주에 처리하였을 때 가장 높은 항암 활성을 보 였고, 숙성별 간장이 비장세포의 증식에 미치는 영향을 확인 한 결과 NK세포 활성에 차이를 나타내었으며 이러한 차이 는 숙성되는 과정중에 간장의 유효성분 변화에 따라 효능의 차이를 보일 것으로 예상하였다.
본 연구 결과에서 게르마늄이 가장 많이 함유 되어있는 쥐 눈이 콩나물에 비하여 인삼 새싹과 브로콜리 새싹이 상대적 으로 매우 높은 항암활성을 보인 것은 인삼 새싹 및 브로 콜 리 새싹에 들어있는 성분에 게르마늄이 더해지면서 항암활성 을 촉진시키는 생리활성 성분의 변화로 인한 것으로 추정되 며, 추후 이에 대한 상세한 연구도 필요할 것으로 사료된다.
3. 게르마늄 함유 농산물의 항염효과
염증 반응은 반응을 준비하는 Priming과 실제로 염증이 진 행되는 Triggering의 2가지 과정으로 진행된다. Triggering 과정의 제일 중요한 특징은 염증복합체(inflamma somes)의 활성화이다(Lamkanfi & Dixit 2014;Man et al. 2017). 염 증복합체는 PRRs 와 염증성 분자들이 결합한 형태의 단백 질 복합체로 NLRP1, NLRP3, NLRP6, NLRP13 ALC NLRC4및 AIM2와 Caspase 4. 5. 11로 구성되어있다 (Lamkanfi & Dixit 2014;Broz & Dixit 2016;Ding & Shao 2017;Man et al. 2017;Yi 2017;Mathur et al. 2018). 이러한 염증복합체들은 염증질환 및 감염질환의 발병 요인이 되는 염증 반응을 활성화 시키는데, 염증복합체의 활 성화는 세포막 천공을 형성하고 염증성 세포사인 pyroptosis 를 유도함과 동시에 Caspase-1의 가수분해를 통한 활성화 및 Caspase-1에 의한 염증성 cytokines으로 알려진 IL1-β, IL- 18의 성숙과 분비를 촉진한다(Man et al. 2017;Shi et al. 2017).
본 연구는 염증복합체인 NLRP3, ASC와 caspase-1, caspase-1에 의한 염증성 cytokine IL1-β의 세포내 발현양상 을 통하여 게르마늄을 함유하고 있는 농산물 A, B, C, D, E 의 항염효과를 분석하였다. NLRP3는 대조군에 비하여 쥐눈 이 콩나물(A)과 인삼 새싹(B), 브로콜리 새싹(D)에서 발현 억제를 보였고, ASC에서는 인삼 새싹 (B)과 브로콜리 새싹 (D)이 대조군과 비슷한 수준에서 발현되었으며, IL-1β에서는 쥐눈이 콩나물(A)과 인삼 새싹(B), caspase-1에서는 쥐눈이 콩나물(A)이 분자의 발현을 가장 많이 억제하는 것으로 나 타났다(p<0.05)<Figure 4>. 5가지 실험군중에서 쥐눈이 콩나 물(A)은 모든 염증분자에서 낮은 발현율을 보였다. 각 실험 군마다 염증반응에 관여하는 분자의 발현율에 차이를 보인 것은 다양한 종류와 양의 영양 성분을 가지고 있는 농산물 들이 염증과 관련된 여러가지 분자의 작용경로에 각각 다른 반응을 보이기 때문으로 추정되며, 각 게르마늄 함유 농산물 에서 게르마늄 함량에 따른 항염 효과에 대해서는 염증관련 분자에 대한 보다 깊은 연구가 필요하다.
IV. 요약 및 결론
본 연구는 이온화 기기를 사용하여 고함량 게르마늄 농축 수를 제작하고, 이 농축수를 다량 희석하여 재배한 농산물에 서 게르마늄의 함량 분석과 효능분석을 통하여 질병을 예방 하고 인체 건강에 도움을 주는 식품 소재를 개발하고자 시 도하였다. 천연의 게르마늄 농축수로 재배한 쥐눈이 콩나물, 인삼 새싹, 들깨 새싹, 브로콜리 새싹 및 상추 새싹에서 다 량의 게르마늄 성분이 검출되었고, 모든 실험군에서 비교적 높은 항산화 및 항암 활성을 나타내었으며(p<0.05), 인삼 새 싹과 브로콜리 새싹 추출물은 대조군에 비하여 전립선암세 포주인 PC-3에 매우 강력한 항암활성을 보였다(p<0.001). 이 중에서도 특히 게르마늄의 함량이 제일 많은 쥐눈이 콩나물 은 염증복합체인 NLRP3와 cytokine분자의 발현을 강하게 억 제함으로서 가장 높은 항염 활성을 보여주었다(p<0.01).
기존의 게르마늄 함유 농산물 생산 방식은 무기 게르마늄 을 비료(Lee et al. 2008;Seo et al. 2010)로 사용하거나, 게르마늄 암석 분말을 첨가한 물을 사용(Kim et al. 2002, Kim et al. 2004)하였으나, 본 연구에서는 천연의 고농축 게 르마늄수를 제작하여 사용하였고, 이로 인하여 농도 조절이 가능한 게르마늄수의 공급이 가능하게 되었다. 이러한 방식 으로 재배한 새싹에서 게르마늄의 함량을 분석하고, 항산화, 항암, 항염 활성과 게르마늄과의 상관관계를 확인하여 세계 최초로 보고하는 바이다. 전립선 암에 강력한 항암효과를 나 타낸 인삼 새싹과 브로콜리 새싹은 암을 예방하거나 치료하 는 의약품 보조 식품소재로 활용 할 수 있을 것이며, 이러한 결과들은 다량의 게르마늄을 함유하고 있는 농산물들이 국 민 건강에 도움을 주는 웰니스 보조 식품의 신소재로서의 사 용 가능성을 강력하게 시사하는 것이다. 또한 게르마늄 농축 수를 활용하면, 고농도 유기 게르마늄을 함유하는 농산물의 대량생산이 가능하고, 다양한 생리활성 성분에 유기 게르마 늄이 더해져 항산화 및 항암 또는 항염효능이 증가한 농산 물을 생산할 수 있어 농가의 부가가치를 높이고 국민 건강 에도 크게 기여할 것으로 기대된다.
