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ISSN : 1225-7060(Print)
ISSN : 2288-7148(Online)
Journal of The Korean Society of Food Culture Vol.37 No.5 pp.438-445
DOI : https://doi.org/10.7318/KJFC/2022.37.5.438

Antioxidant and Immunomodulatory Effects of Laminaria japonica Water Extract

Jiamei Cui1, Eunyoung Kim1, Guiguo Zhang2, Yunkyoung Lee1,3*
1Department of Food Science and Nutrition, and Korea-China Joint R&D center on Plant-derived polysaccharide, Jeju National University
2College of Animal Science and Technology, and Korea-China Joint R&D center on Plant-derived polysaccharide, Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Biotechnology and Disease Control and Prevention, Shandong Agricultural University
3Interdisciplinary Graduate Program in Advanced Convergence Technology & Science, Jeju National University
* Corresponding author: Yunkyoung Lee, Department of Food Science and Nutrition, Jeju National University, 102 Jejudaehak-ro, Jeju 63243, Republic of Korea Tel: +82-64-725-2539 Fax: +82-64-725-2539 E-mail: lyk1230@jejunu.ac.kr
August 23, 2022 August 31, 2022 August 31, 2022

Abstract


Laminaria japonica is a type of brown algae widely consumed in Asian countries and contains many essential nutrients and exhibits anti-obesity, antioxidant, and anti-inflammatory effects. In this study, the antioxidant and immunomodulatory effects of a Laminaria japonica water extract (LJE) were investigated using an in vitro model. Mean total polyphenol content of LJE was 2.16±0.11 μg GAE/mg, and LJE dose-dependently inhibited ABTS radical activity but did not scavenge DPPH radicals. In addition, LJE enhanced nitric oxide (NO) production and upregulated the mRNA expressions of proinflammatory cytokines (i.e., tumor necrosis factor-α and interleukin-6) in RAW 264.7 cells. On the other hand, LJE inhibited NO production and downregulated proinflammatory cytokine mRNA levels in endotoxin-stimulated RAW 264.7 cells. Thus, our data show that LJE has moderate antioxidant activity and biphasic immunomodulatory effects on RAW 264.7 cells. In summary, the study indicates that LJE has potential therapeutic use as a novel biphasic immuno-modulator.


Laminaria japonica , extract , antioxidant , immunomodulatory , anti-inflammatory effect

다시마 추출물의 항산화와 염증 조절 효과

최 가미1, 김 은영1, Zhang Guiguo2, 이 윤경1,3*
1제주대학교 식품영양학과, 한-중 식품유래 기능성 다당류 공동 연구개발센터
2산동농업대학교 동물영양학과, 중-한 식품유래 기능성 다당류 공동 연구개발센터
3제주대학교 차세대융복합과학기술협동과정

초록

    I. 서 론

    아시아 일부 국가들에서 식용으로 섭취되는 해조류의 다 양한 건강증진 효과들이 보고되고 있다. 그 중 갈조류인 다 시마(Laminaria japonica, LJ)는 저열량 식품으로 비타민, 미 네랄, 식이 섬유 등이 풍부하며, 식품 첨가물, 동물의 사료, 비료, 화장품의 원료 등으로 적용되고 있다(Yoo & Lee 2004). 예로부터 다시마는 중국 전통 약제로써 부종, 요오드 결핍 질환, 위 질환 등에 대한 치료효과가 알려져 있으며(Li et al. 2022), 세포 및 동물실험을 통해 다시마의 항산화(Kim et al. 2011), 항염증(Lin et al. 2016), 항비만(Oh & Lee 2015), 항당뇨(Cho & Bang 2004), 암세포의 증식 저감 효 과(Zhu et al. 2016)와 고지혈증의 개선 효과(Kim et al. 2002) 등 다양한 건강증진 효과들이 보고되었다.

    천연물로부터 다양한 생리활성 성분을 추출하기 위한 다 양한 추출방법이 연구되어 왔으며, 이러한 추출방법에서 용 매의 종류, 추출 시간, 추출 온도 등의 조건들은 천연물(예, 해조류)로부터 추출되는 성분과 그 생리활성에 직접적인 영 향을 미친다. 예를 들어 추출 용매에 따라 생리활성의 차이 를 보고한 선행연구에서 갈조류(다시마, 톳, 미역, 모자반) 물 추출물은 에탄올 추출물에 비해 지방생성 저해 효과가 유의 적으로 탁월하였다(Oh & Lee 2015). 또한 해조류 5종(미역, 다시마, 김, 파래, 톳)의 물 추출물도 에탄올과 메탄올 추출 물과 비교하여 추출 수율, 환원당 함량, 총 폴리페놀 함량을 높을 뿐만 아니라, 항산화, 미백효과(tyrosinase 저해효과)도 뛰어난 것을 확인하였다(Na et al. 2014).

    염증은 신체의 자연적인 방어 기전으로 체내의 면역세포 가 외부의 자극이나 세균 감염을 인지하고 다양한 염증 매 개체를 분비하여 손상된 조직을 치유하고 재생시키는 과정 이다. 지나친 면역 활성은 만성 염증을 유도할 수 있으며, 다 양한 만성 염증 관련 질환은 중요한 사망 위험 요인으로 작 용한다. 세계적으로 5명 중 3명이 뇌졸중, 만성 호흡기 질환, 심장병, 암, 당뇨병과 같은 만성 염증과 관련된 질환들로 인 해 사망한다고 보고 되고 있다(Pahwaet et al. 2021). 항염증 약물로 다양한 비스테로이드항염증제가 개발·처방되어 왔지 만 장기간의 복용은 위, 장의 궤양, 부종, 신장질환, 골다공 증, 감염 등의 부작용을 일으킬 수 있다(Kim 2004). 그러므 로 이러한 만성 염증의 예방·치료에 도움을 주고, 동시에 부 작용을 최소화시킬 수 있는 천연물 유래 염증 조절 물질들 에 대한 연구가 활발히 진행되어 오고 있다.

    염증 상태를 세포실험에서 재현하기위해서 내독소인 lipopolysaccharide (LPS)를 이용하는데, LPS는 지질과 다당 류로 구성된 거대 분자로, 그람 음성 박테리아 외막의 주성 분이다. 대식세포는 이러한 LPS의 자극에 의해 염증 신호기 전이 활성화되어 nitric oxide (NO), tumor necrosis factor- α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β)와 같은 다양한 염증관련 인자 및 사이토카인의 생산이 증가한 다. 대부분의 항염증 연구들은 내독소로 염증 상태를 유도하 여 항염증 효과를 측정하는데 초점을 맞춰 염증이 없는 정 상상태에서 타겟 물질의 염증활성의 관찰연구는 상대적으로 미비하다. 이에 본 연구에서는 다시마 물 추출물(Laminaria japonica extract, LJE)의 항산화 효과를 포함한 이화학적 특 성을 살펴보고, mouse 대식세포주를 이용하여 LJE의 세포 독성과 정상수준과 LPS로 염증을 유도한 상태에서 LJE의 면 역활성 효과 및 항염증 효과를 확인해 보고자 하였다.

    II. 연구 내용 및 방법

    1. 시료의 추출

    본 실험에 사용된 다시마는 한국 제주시 전통시장에서 구 입하여 세척, 탈염 및 동결 건조 과정 처리하여 분쇄시켰다. 동결 건조된 다시마 분말에 3차 증류수(30 g에 1 L)를 첨가 하여 상온에서 24시간 교반 시킨 후, 진공 여과의 과정을 거 쳐 62°C에서 여과액 양의 반까지 농축시켰다. 최종적으로 LJE의 농축된 용액을 얻었으며, 이를 동결건조시켜 획득한 파우더를 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS, Gibco, Gaithersburg, MD, USA)에 용해, 필터로 여과하여 −20°C에 보관하면서 세포실험에 사용하였다.

    2. 총 폴리페놀 함량

    LJE의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 이용해서 측정하였다(Folin & Denis 1912). LJE (8 mg/mL) 50 μL와 동량의 1M Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (FMD Millipore Corporation, Burlington, MA, USA)를 96-well plate에 첨 가해서 실온에서 6분을 반응시키고, 2% Na2CO3 solution 100 μL를 첨가해서 암실에서 추가로 30분 더 반응시켰다. Gallic acid (Sigma, MO, USA)를 사용하여 표준곡선을 도 출하였으며, microplate reader (Molecular devices, CA, USA)를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 의 총 폴리페놀 함량은 gallic acid concentration equivalents (GAE)를 기준으로 산출하였다.

    3. 다시마 물 추출물의 항산화능 측정

    1) ABTS 라디칼 소거능

    LJE의 항산화능은 ABTS 라디칼 소거능 분석법을 이용하 여 측정하였다(Re et al. 1999). ABTS (2,2′-Azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 7.4 mM로 준비하여 동량의 2.6 mM potassium persulfate (1:1) 와 혼합하여 암실에서 12-24시간 동안 반응시켜, ABTS stock solution으로 사용하였다. ABTS stock solution는 735 nm에서 흡광도가 1.40-1.50이 되도록 증류수로 희석하여 실 험에 사용하였다. 농도별로 준비한 25 μL의 LJE (0.08, 0.4, 0.8, 1.6, 8 mg/mL)는 ABTS working solution 175 μL와 혼합하여 실온에서 30분 동안 반응시켜, 735 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid를 positive control로 사용하여, 다음 식과 같이 LJE의 ABTS 라디칼 소거능을 계산하였다.

    ABTS radical scavenging activity (%)   = [ 1 − ( OD sample − OD sample blank /OD control ) ] × 100

    • OD: optical density

    2) DPPH 라디칼 소거능

    LJE의 항산화능은 DPPH 라디칼 소거능 분석법을 이용하 여 측정하였다. 농도별로 준비한 25 μL의 LJE (0.08, 0.4, 0.8, 1.6, 8 mg/mL)는 0.2 mM DPPH (2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl)나 DMSO (background) 175 μL를 96-well plate에 첨가하고 실온에서 30분 반응시켰다. 515 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid를 positive control로 사용하여, 다음 식과 같이 LJE의 DPPH 라디칼 소거능을 계산하였다.

    DPPH radical scavenging activity (%)   = [ 1 − ( OD sample − OD sample blank /OD control ) ] × 100

    • OD: optical density

    4. 대식세포주 배양 및 LJE의 세포 독성 측정

    대식세포, RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, 1Manassas, USA.)에서 구매하여 실험에 사용하였다(Cui 2021). 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (P/S) 포함된 highglucose Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM-high glucose) 배지를 사용하고 37°C, 5% CO2에서 배양했다. 본 실험에서 사용된 RAW 264.7 세포는 모두 passages 30 이 하였으며, 모든 세포 배양 시약은 Gibco (BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 구매하였다. 세포생존율의 측정은 tetrazolium salt (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, or MTT) assay를 이용하였다. 우선 RAW 264.7 세포는 0.25×106 cells/well의 농도로 24-well plates에서 1% FBS, 1% P/S 포함된 DMEM-high glucose에서 배양하여, 다양한 농도의 LJE (1, 10, 25, 50 μg/mL)로 24시간 처치하 였다. MTT solution 5 mg/mL를 well에 분주하여 3-4시간 추가 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO를 첨가해서 생성 된 formazan이 충분히 용출될 수 있도록 교반시켰다. 최종 반응액 50 μL를 96-well plate로 옮겨 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 다음 식을 이용해서 계산하였다.

    Cell viability (%) = (OD of sample/OD of control)×100

    5. Nitric oxide (NO) 생성량 측정

    NO 생성량 측정은 Griess 반응법을 이용하여 측정하였다 (Yang et al. 2019). Six-well plate에서 16-18시간 배양한 RAW 264.7 세포(1×106 cells/well)에 LJE 1 μg/mL를 6시 간 처치 후에 LPS(100 ng/mL)를 첨가해서 총 24시간을 배 양하였다. 시료의 상층액 50 μL와 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 96-well plate에 분주하여 실온에서 10-15분 반응시켰다. Microplate reader를 이용하여 540 nm를 흡광도를 측정하였다. Nitrite 생성량은 sodium nitrite (NaNO2)를 이용해서 만든 표준 곡선 값을 이 용하여 계산하였으며, LPS 처치군의 NO 값을 양성대조군으 로 사용하였다.

    6. Total RNA 추출 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(realtime RT-PCR)을 이용한 mRNA 발현 분석

    RAW 264.7 세포의 total RNA 추출은 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하였다. 배양액을 제거 한 세포를 PBS로 2-3회 세척한 후 TRIzol reagent를 처리하여 균질화하고 chloroform (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 원심분리(12,000 rpm, 4°C, 15분) 하 였다. 원심분리 후 획득한 RNA를 포함하는 상층액과 동량 의 isopropyl alcohol을 첨가하여 total RNA를 침전 분리하 였다. Total RNA 정량은 NanoDrop spectrometer (Nano200 MicroSpectrophotometer, Hangzhou, China)를 이용하였으며, 260/280 nm 파장에서 측정된 흡광도의 비율이 1.8-2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA를 mRNA 발현 분석에 사용하였다. cDNA 합성은 total RNA 2 μg를 high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 이용하였고, 제조된 cDNA로 염증성 사이토카 인 유전자의 발현을 측정하기 위해 SYBR Green Master mix를 이용하여 real time RT-PCR을 수행하였다. 이때 PCR 조건은 50°C/2분, 95°C/2분, 95°C/15초, 60°C/1분으로 40회 반복하여 증폭하였으며, CFX96TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, CA, USA)을 이용하였다. 측정하고자 하 는 목적 유전자의 발현은 표준대조군(internal housekeeping gene)인 Rplp0 (36b4)의 발현량을 이용하여 정량화 하였으며, 분석에 사용한 각각의 primer(Macrogen, Seoul, Korea) 염 기서열은 <Table 1>과 같다.

    7. 염증관련 사이토카인 생성량 측정

    염증성 사이토카인 생성량은 ELISA assay를 사용하였다 (Cui et al. 2022). Six-well plate에서 16-18시간 배양한 RAW 264.7 세포에 LJE 1 μg/mL를 6시간 처치한 후 LPS 를 첨가해서 총 24시간을 배양하였다. 시료의 상층액(TNF- α: 500배; IL-6: 50배 희석)은 ELISA kit (TNF-α, IL-6: BD PharMingen, San Jose, CA, USA)를 이용하여 판매처 의 protocol에 따라 실험을 진행한 후에 450 nm 및 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. ELISA kit에 포함되어 있는 TNF-α와 IL-6 단백질을 이용하여 얻은 표준곡선을 통해 시 료의 처치로 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 생성량을 산출하였다.

    8. 통계 처리

    모든 데이터는 GraphPad Software, Prism 8.0.1 (San Diego, CA, USA)을 이용하였다. 기술통계분석을 실시하여 평균과 표준편차/표준오차를 구했으며, 실험 처치군에 따라 analysis of variance (ANOVA) one-way multiple comparison (Dunnett’s 혹은 Tukey’s multiple comparisons) 또는 t-test (p<0.05)를 실시하였다. 모든 값은 평균±표준편차/오차로 나 타냈다.

    III. 결과 및 고찰

    1. 다시마 물 추출물(LJE)의 총 폴리페놀 함량

    LJE의 총 폴리페놀 수치는 2.16±0.11 μg GAE/mg로, 이는 선행연구 Kang et al. (2018)의 연구 결과에서 보고된 다시 마 물 추출물의 폴리페놀 함량 2.08±0.01 μg GAE/mg 및 Hwang et al. (2017)의 연구 결과에서 보고한 다시마 물 추 출물의 총 폴리페놀 함량 2.57±0.37 μg GAE/mg과 유사한 수치를 나타냈다(Kang et al. 2018;Hwang et al. 2017). 그 이외에, Kim et al. (2011)의 연구에서 LJE 총 폴리페놀 수치는 0.35 μg GAE/mg으로 나타났다(Kim et al. 2011). Na et al. (2014)의 연구에서 LJE 총 폴리페놀 수치는 4.3±0.8 μg tannic acid/mg으로 나타났다(Na et al. 2014). 열풍 건조로 인해 다시마의 폴리페놀 성분의 파괴가 발생할 수 있으므로 본 연구에서 다시마는 동결건조 방법을 사용하 였다(Baek et al. 2019). 본 실험실에서 최적화한 물추출법이 지속적으로 유사한 결과물을 만들어 낸다는 점과 2017년, 2018년 및 2019년 3년간 사용한 국내산 다시마 물추출물의 폴리페놀 성분은 유의적인 차이가 없다는 것을 확인하였다.

    반면 Lee(2013)의 연구에서는 다양한 해조류(김, 미역, 다 시마, 톳)의 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량을 비교하 였는데, 그 중 다시마 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 10.09 μg GAE/mg으로 나타났다(Lee 2013). Kwak et al. (2005)의 연구에서는 해조류(미역, 다시마, 톳, 파래, 김)의 에 탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량을 비교한 결과중에서 다 시마 에탄올 추출물은 1.17 μg tannic acid/mg으로 나타났다 (Kwak et al. 2005). 이와 같이 추출 용매 및 다른 실험실의 추출 최적화 프로토콜의 차이에 따라 다시마 추출물의 총 폴 리페놀 함량이 다름을 알 수 있다.

    특히 추출방법 중 온도의 변화 또한 추출물이 함유하는 총 폴리페놀 함량에 영향을 미쳤다(Park et al. 2012). 예를 들 어 Kim et al. (2015)에 의하면 해조류 열수 추출물(9종: 곰 피, 대황, 매생이, 모자반, 미역, 지충이, 청각, 톳, 파래)의 폴 리페놀 함량이 에탄올 추출물 보다 더 낮게 나타났다(Kim et al. 2015). Na et al. (2014)에 의하면 아임계 추출물이 열수 추출물, 용매(에탄올, 메탄올) 추출물 보다 더 높게 나타났다 (Na et al. 2014). 이와 같이 해조류의 추출방법(예, 추출 용 매, 온도 등)은 추출물의 폴리페놀 함량에 직접적인 영향을 주는 것을 확인하였다.

    2. LJE의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성

    LJE의 항산화 효과 측정은 2가지 라디칼 소거 활성 실험 을 실시하였다. ABTS 라디칼 소거능 결과는 <Figure 1A> 와 같다. LJE의 ABTS 라디칼 소거능은 양성 대조군 (Ascorbic acid, AA)보다는 낮았으나, 농도별로 ABTS 라디 칼 수거능이 증가하는 결과를 보였다. LJE 1,000 μg/mL의 농도에서 ABTS 라디칼 소거능 결과는 50.5%로 나타났다.

    LJE의 DPPH 라디칼 소거능 결과는 <Figure 1(B)>와 같 다. ABTS 결과와는 달리 LJE의 DPPH 라디칼 소거능은 가 장 높은 농도인 1,000 μg/mL LJE에서도 라디칼 소거능을 보이지 않았다. Kim et al. (2011)의 연구에서도 본 연구와 유사한 결과를 보였는데, 다시마 물 추출물 1,000 μg/mL 농 도까지는 DPPH 라디칼 소거능이 나타나지 않았으나 2,500 μg/mL 다시마 물추출물의 농도부터 DPPH 라디칼 소거능 5% (50,000 μg/mL에서 86.4%)로 나타났다(Kim et al. 2011). 즉 고농도의 다시마 물 추출물에서 DPPH 라디칼 소거능의 활성이 공통적으로 관찰되었다. 단 본 연구에서는 세포실험 에 적용을 고려하여 1,000 μg/mL LJE 농도 이상으로 진행 하지 않았음은 언급해 둔다. 항산화 활성의 기작은 항산화 물질이 인체내에서 노화와 세포손상을 일으키는 자유 라디 칼을 소거함으로써 산화를 방지하는 것이며, LJE는 ABTS 라디칼 소거능을 통한 항산화능을 가짐을 확인하였다. 또한, LJE의 ABTS와 DPPH 라디칼 소거능의 결과가 상이하게 나 타난 것은 ABTS는 cation 라디칼과 반응하지만 DPPH는 자 유라디칼과 반응하는 기질의 특성 때문으로 사료된다. 이와 유사한 결과는 선행연구들에서도 찾아볼 수 있으며, 예를 들 어 Lee et al. (2021)과 Jung et al. (2019) 연구에서도 타겟 물질의 항산화 측정 방법에 따라 상이한 항산화 효과를 관 찰하였다(Jung et al. 2019;Lee et al. 2021).

    3. LJE 처치가 RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향

    LJE가 RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인 하기 위해 RAW 264.7 세포에 해조류 추출물을 1, 10, 25, 50 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처치한 후 MTT assay를 통해서 세포 독성을 확인하였다<Figure 2>. 그 결과, 대조군 에 비하여 LJE는 10 μg/mL 부터 세포 생존율의 유의적인 감소를 나타냈다. 따라서 MTT assay 결과에 따라 추후 실험 에서는 세포 독성이 나타나지 않는 1 μg/mL LJE를 처치농 도로 결정하여 진행하였다.

    4. RAW 264.7 세포에서 LJE의 처치가 면역활성에 미치는 효과와 기전

    염증은 사이토카인의 활성으로 산화질소 합성효소(iNOS) 에 의해 다량의 산화질소(NO) 형성을 유도한다(Soufli et al. 2016). LJE의 면역활성 효과를 평가하기 위해서 RAW 264.7 세포에서 LJE의 NO 생성량, 다양한 염증관련 사이토카인 (Tnf-α, Il-6 및 Il-1β)의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였 다. RAW 264.7 세포에 LJE를 24시간 처치하였을 때 대조 군에 비해 NO 생성량<Figure 3A>, Tnf-α 및 Il-6 mRNA 생성량을 유의적으로 증가시켰으나, Il-1β의 mRNA 발현량 에는 유의적인 차이를 보이지 않았다<Figure 3B>. 또한, 단 백질 발현 수준에서도 LJE의 처치는 대조군에 비해 염증성 사이토카인 TNF-α 생성량을 유의적으로 증가시켰으나, IL- 6의 생성량에는 유의적인 변화를 보이지 않았다<Figure 3C>. Fang et al. (2015)의 연구에서도 본 연구와 유사한 결과를 제시하였는데, 다시마 유래 다당류가 RAW 264.7 세포에서 NO 생성량, 염증성 사이토카인 Tnf-α, Il-6, Il-1β 생성량 및 mRNA 발현을 유의적으로 증가하여 다시마 유래 다당류의 면역활성효과를 보고하였다(Fang et al. 2015). 즉, RAW 264.7 세포에 LJE를 단독 처치는 LJE의 면역활성효과의 보 여 주었다.

    5. LPS로 염증유도한 RAW 264.7 세포에서 LJE의 항염증 효과와 기전

    LJE의 항염증 능력 효과를 확인하기 위해서 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포에서 LJE의 NO 생성량, 다양한 염 증관련 사이토카인(Tnf-α, Il-6 및 Il-1β)의 mRNA 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다. LJE는 LPS로 유도된 NO 생성량을 유의적으로 감소시켜 항염증 효과를 보여 주었다 <Figure 4A>. Choi et al. (2008)의 연구에서는 다시마 메탄 올 추출물이 LPS로 유도한 NO 생성량을 20-30% 감소시켜 본 연구 결과와 비슷하게 나타났다(Choi et al. 2008). LPS 로 염증유도한 RAW 264.7 세포에 LJE의 처치는 대조군과 비교하여 염증성 사이토카인 Tnf-α, Il-6 및 Il-1β mRNA의 생성량의 유의적인 차이가 없었으나<Figure 4B>, LJE는 LPS에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 단백질 TNF-α 및 IL-6의 분비를 유의적으로 억제하였음을 확인하였다<Figure 4C>. 즉, LJE의 RAW 264.7 세포에서의 사이토카인 분비의 조절을 통한 항염증 효과는 전사(transcription) 차원에서의 조절보다는 번역(translation)차원에서의 조절이 더 큰 영향을 미치는 것으로 보인다. Park et al. (2013)의 연구에서도 다 시마 물 추출물은 LPS에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 생성량을 감소한 결과를 보여 본 연구와 유사하였다(Park et al. 2013). 또한 다른 선행연구에 의하면 다시마 물 추출물 뿐만 아니라 발효 다시마가 염증신호전달 관련 단백질인 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 와 c-JUN NH2-terminal protein kinase (JNK)의 인산화를 통한 잠재적 항염증 효과를 기전을 제시하였고, 다시마 유래 다당류의 처치가 nuclear factor kappa-B (NF-κB) 및 mitogenactivated protein kinases (MAPKs) 신호통로의 억제를 통한 항염증 기전을 보고한 바 있다(Hwang et al. 2017;Peng et al. 2015).

    본 연구 결과에서 보여준 대식세포의 정상상태와 염증상 태에서 LJE의 상이한 면역조절 효과(이상성반응, biphasic response)는 Liu et al. (2017) 연구에서도 보고된 바 있다. 즉, 미생물 유래 다당류, xanthan gum은 RAW 264.7 세포 에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성량을 농도 의존적으로 증 가시키는 반면에 LPS로 염증 유도 상태에서의 xanthan gum 처치는 증가한 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성량을 농도 의존 적으로 감소시켰다(Liu et al. 2017). 이와 같이 다시마 물 추출물과 미생물 유래 다당류는 정상상태에서는 염증성 사 이토카인 분비를 촉진하는 반면 염증상태에서는 생산량이 증 가한 사이토카인의 수치를 감소시키는 면역활성과 항염증 효 과, 즉 biphasic 염증조절 효과를 가진다.

    IV. 요약 및 결론

    본 연구에서는 LJE의 총 폴리페놀 함량은 2.16±0.11 μg GAE/mg로 나타났다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 이용하여 LJE의 항산화 효과를 분석한 결과, 농도별로 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 결과가 나타났으며 LJE 1,000 μg/mL의 농도에서 50.5%의 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 반면 LJE의 DPPH 라디칼 소거능은 관찰되지 않았 다. 농도별 LJE (1-50 μg/mL)를 RAW 264.7 세포에 처치하 여 세포독성을 확인한 결과, LJE 1 μg/mL 농도에서 세포독 성을 나타내지 않아, 이를 처치 농도로 결정하여 실험을 진 행하였다. RAW 264.7 세포에서 LJE의 처치는 NO 생성량 을 대조군에 비해 유의적으로 증가시켰으나, 염증유도한 RAW 264.7 세포에서 LJE의 처치는 LPS로 증가한 NO 생 성량을 유의적으로 감소시켰다. 또한 LJE의 처치는 정상상 태의 RAW 264.7 세포에서 Tnf-α, Il-6 mRNA 발현량 및 TNF-α 생성량을 대조군에 비해 유의적으로 증가시켰다. 반 면에, LPS로 염증유도한 RAW 264.7 세포에서 LJE의 처치 는 증가한 TNF-α 및 IL-6 생성량을 유의적으로 감소시켰 다. 이와 같이 본 연구에서는 LJE는 항산화 효과를 가지며, mouse 대식세포모델에서 정상상태에서는 면역활성 효과를 염증상태에서는 항염증 효과를 가짐을 확인하였다.

    감사의 글

    본 연구는 the National Key R&D Program of China- Korea Cooperative Project 2019YFE0107700와 한국연구재 단 NRF-2019K1A3A1A20081146의 지원에 의해 수행되었 으며, 이에 감사드립니다.

    Figure

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    ABTS and DPPH radical scavenging activity of LJE.

    (A) ABTS radical scavenging activity of LJE, (B) DPPH radical scavenging activity of LJE. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared with control group (0 μg/mL concentration). Abbreviations: LJE, Laminaria japonica extract; AA, Ascorbic acid.

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    Cellular toxicity of LJE in RAW 264.7 cells.

    Cytotoxicity of LJE on RAW 264.7 cells determined via an MTT assay. The data are presented as the mean±SEM of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA. Asterisks (*) indicate significant differences of p <0.05. Abbreviations: MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; LJE, Laminaria japonica extract.

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    Immunomodulatory effect of LJE on RAW 264.7 cells.

    RAW 264.7 cells were pretreated with LJE (1 μg/mL) for 24 hrs. (A) Effect of LJE on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells. (B) Effect of LJE on Tnf-α, Il-6 and Il-1β mRNA expression in RAW 264.7 cells. (C) Effect of LJE on proinflammatory cytokines TNF-α production in RAW 264.7 cells. The data are presented as the mean±SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using t-test. Asterisks (*) indicate significant differences from control (*p<0.05, **p<0.01). Abbreviations: LJE, Laminaria japonica extract, NO: nitric oxide, TNF-α: tumor necrosis factor-α, IL-6: interleukin-6, IL-1β: interleukin-1β.

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    Anti-inflammatory effect of LJE on LPS-induced RAW 264.7 cells.

    RAW 264.7 cells were pretreated with LJE (1 μg/mL) for 6 hrs, then incubated with LPS (100 ng/mL) for another 18 hrs. (A) Effect of LJE on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells. (B) Effect of LJE on Tnf-α, Il-6 and Il-1β mRNA expression in RAW 264.7 cells. (C, D) Effect of LJE on proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 production in RAW 264.7 cells. The data are presented as the mean±SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using t-test. Asterisks (*) indicate significant differences from LPS treated group (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). Abbreviations: LJE, Laminaria japonica extract, NO: nitric oxide, TNF-α: tumor necrosis factor-α, IL-6: interleukin-6, IL-1β: interleukin-1β.

    Table

    Primer sequences for RT-qPCR

    Total polyphenol contents of LJE

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