I.서 론
Hydroxyl radical (·OH), superoxide anion radical (·O2−), hydrogen peroxide (H2O2), peroxy radical (ROO·), singlet oxygen (1O2) 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 노화, 암, 동맥경화, 당뇨병과 같은 인체질환을 유발 하거나 악화시키는 주요 원인으로 보고되고 있다(Aruoma 1994; Halliwell et al. 1995; Samak et al. 2009). 활성산소 와 관련된 질환에서 항산화물질의 효능이 인정되면서 활성 산소종을 제거하기 위한 항산화제의 사용이 증가하고 있는 데 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) 등의 합성항산화제는 가격이 저렴하고 효능이 매우 우수한 장점이 있으나 세포 내 독성을 나타내거나 암을 유 발할 수 있다는 보고(Branen 1975)가 있어 최근에는 이를 대체할 수 있는 식물소재의 천연 항산화 물질의 개발요구가 높아지고 있다. 이에 채소, 과일, 자생식물들로부터 항산화 효과가 우수한 종을 발굴하려는 연구가 활발히 진행되고 있 는데 그 중 과일은 기호성과 항산화력이 우수하며 특히 유 리기를 소거하는 능력이 탁월한 것으로 보고되고 있어 지속 적인 관심을 받고 있다(Lee et al. 2012).
키위(Actinidia deliciosa)는 다래나무과(Acinidiaceae) 다래 나무속(Acinidia)에 속하는 덩굴성 나무로 원산지는 중국 양 자강 유역의 아열대지역이다. 우리나라에서는 흔히 참다래라 부르기도 하며(Jeong et al. 2007) 과육의 색에 따라 그린키 위, 골드키위, 레드키위 등으로 분류하는데 전 세계적으로 가 장 많이 재배되고 있는 것은 그린키위 품종이다(Kim et al. 2013). 우리나라에는 1977년 뉴질랜드산 품종이 도입되어 재 배되기 시작하였으며 2007년부터 국내에서 육성한 품종들이 속속 개발되어 외국산 키위와 경쟁을 벌이고 있다(Rho et al. 2002). 키위는 비타민 C와 섬유소가 풍부할 뿐 만 아니라 나 트륨이 적고 칼륨이 많아 고혈압 예방효과가 있으며 단백질 가수분해 효소인 actinidin이 함유되어 있어 육류 연화작용이 있는 과일로 알려져 있다(Rho et al. 2002; Jeong et al. 2007). 또한 키위에는 quinic acid, malic acid, citric acid 등의 유기산이 다량 함유되어 있어 특유의 풍미를 지니고 있 다(Jin et al. 2014). 우리나라는 키위를 연중 소비하고 있고 최근 들어 골드, 그린, 레드 등 다양한 색상의 키위가 국내 에서도 생산되어 그 수요가 매년 증가하고 있다. 이에 본 연 구에서는 국내에서 생산되는 키위의 색상별 항산화능 및 아 질산염 소거능을 비교 탐색하여 기능성 소재로서의 선택적 이용 가능성을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
II.연구 내용 및 방법
1.재료
본 실험에 사용한 키위는 충남 소재 농원에서 2014년 9월 에 구입하여 각각의 조직을 파쇄한 후 동결건조기(TFD, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 건조한 다음 분말화하여 −20 ℃에 냉동보관하며 사용하였다. Folin-ciocalteau's phenol reagent, gallic acid, naringin, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, tyrosinase, ferrozine, potassium ferricyanide, sodium nitrite 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 그 외에 사용된 시약은 특급 및 일급을 구입하여 사용하였다.
2.추출액의 제조 및 추출수율 측정
추출물의 제조는 각각의 분말 시료에 20배의 70% 에탄올 을 가하고 80℃에서 2시간 환류냉각 추출과정을 2회 반복하 였다. 추출액을 여과지(Whatman filter paper No. 1)로 여과 한 후 진공농축기(Buchi R-114, Flawil, Switzerland)로 감압 농축하여 동결 건조시킨 다음 각각의 추출수율을 측정하였 다. 이 중 일부를 취하여 1, 5, 10, 20 mg/mL의 농도가 되 도록 50% dimethyl sulfoxide에 용해하여 시료를 제조하였 으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 1 mg/mL 농도로 제 조하여 사용하였다.
3.총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Dewanto et al.(2002)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 0.1 mL에 증류수 1.9 mL 와 Folin-ciocalteau’s phenol reagent 0.2 mL를 가하여 실온 에서 3분간 반응시킨 후 포화 Na2CO3 용액 0.4 mL와 증류 수 1.9 mL를 가하여 혼합하였다. 이것을 실온에서 1시간 반 응시킨 후 725 nm (Smart Plus SP-1900PC, Seoul, Korea) 에서 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 gallic acid를 이 용하여 농도별 표준곡선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량을 gallic acid 기준으로 환산하였다.
4.DPPH radical 소거능 측정
시료용액의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법(1958)에 준하여 측정하였다. 각 시료용액 0.3 mL에 0.1 mM DPPH 용액 2 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.
5.ABTS radical 소거능 측정
시료 용액의 ABTS radical 소거능은 Re et al.(1999)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate 용액을 14:1로 혼합(v/v)하여 실온의 어 두운 곳에서 20시간 동안 반응시킨 후 증류수를 가하여 734 nm에서의 흡광도값이 0.70 내외가 되도록 희석하였다. 이 중 1.6 mL를 취하여 시료용액 0.1 mL를 가하고 실온에서 5분간 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨 가군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.
6.Tyrosinase 저해 효과
시료용액의 tyrosinase 저해 효과는 Yagi(1987)의 방법을 변형하여 측정하였다. 기질로서 10 mM L-DOPA 0.2 mL와 0.175 M phosphate buffer (pH 6.8) 0.2 mL에 시료용액 0.5 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 mushroom tyrosinase (110 unit/mL) 0.1 mL를 가하였다. 이 혼합액을 35℃에서 2분 간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가 군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.
7.Metal chelating effect 측정
시료용액의 metal chelating effect는 Gulcin(2006)의 방법 을 약간 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 0.5 mL에 2 mM FeCl2 0.05 mL를 가하고 5 mM ferrozine 0.05 mL와 ethanol 2mL를 가한 후 실온에서 10분간 방치한 다음 562 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광 도 비(%)로 나타내었다.
8.환원력 측정
시료용액의 환원력 측정은 Wong & Chye(2009)의 방법을 변형하여 각 시료용액 0.5 mL에 0.2M phosphate buffer (pH 6.6) 0.5 mL와 1% potassium ferricyanide 0.5 mL를 혼합하여 50℃에서 20분간 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액 0.5 mL와 0.1% FeCl3 0.2 mL를 가한 다음 700 nm에 서 흡광도를 측정하였다.
9.아질산염 소거능 측정
시료용액의 아질산염 소거능(nitrite scavenging activity)은 Kato et al. (1987)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 용액 0.5 mL에 1 mM sodium nitrite 0.1 mL를 가하고 0.1 N HCl (pH 1.2) 0.4 mL를 가한 다음 37℃에서 1시간 동안 반 응시켰다. 그 후 2% acetic acid 2 mL와 Griess 시약 0.4 mL를 가하고 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간 의 흡광도 비(%)로 나타내었다.
10.통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 SPSS (Version 12.0 for Window)를 이용하여 평균±표준편차를 구하였다. 분 산분석(ANOVA)을 실시하여 유의적 차이가 있는 항목은 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 실 시하여 시료간의 유의차를 p<0.05에서 검정하였다.
III.결과 및 고찰
1.추출 수율 및 총 폴리페놀 함량
키위를 70% 에탄올로 추출한 후 추출 수율 및 총 폴리페 놀 함량을 측정한 결과는 <Table 1>과 같다. 추출 수율은 골 드키위 64.42%, 그린키위 55.20%, 레드키위 73.45%로 나타 났다(p<0.05). 총 폴리페놀 함량은 골드키위와 그린키위가 각 각 3.09 mg GAE/g과 2.71 mg GAE/g으로 유의적인 차이 없이 나타난 반면, 레드 키위는 4.59 mg GAE/g으로 유의적 으로 높게 나타났다(p<0.05). Jin et al.(2014)은 키위의 80% 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량을 3.16 mg GAE/g으로 보고하여 본 실험의 결과와 유사하였다. 반면에, Park et al. (2014)은 7종류 키위 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량을 4.18~14.48 mg GAE/g으로 보고하였고, Jeong et al.(2007) 은 골드 키위 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량을 0.047 mg GAE/g으로 보고하여 본 실험의 결과와 차이를 보였다. 이와 같이 폴리페놀 함량에 차이가 나는 것은 품종, 재배지, 재배 환경, 분석방법 등이 각기 다르기 때문에 나타난 것으로 추 측된다. 폴리페놀 화합물은 과일, 채소, 허브 등의 식물계에 널리 분포되어 있으며 항노화, 항암, 혈중 콜레스테롤 농도 감소, 골다공증 개선 등의 효과가 우수한 것으로 보고되고 있다(Graf et al. 2005). 또한 폴리페놀 화합물은 항산화 활 성과 밀접한 관계가 있는데 키위에는 pyrogallol, quercetin, ferulic acid, gallic acid 등이 주된 폴리페놀 성분으로 존재 하는 것으로 알려져 있다(Bursal & Gulcin 2011) 따라서 본 실험에서는 총 폴리페놀 함량이 높은 레드 키위에서 항산화 활성이 높게 나타날 것으로 예측된다.
2.DPPH radical 소거능
DPPH radical 소거능은 DPPH radical이 항산화 활성을 갖는 물질과 반응하면 짙은 보라색이 탈색되어 흡광도가 감 소하는 원리를 이용하여 측정하는데(Gulcin et al. 2005) 방 법이 간단하고 단시간 내에 많은 시료의 항산화능을 측정할 수 있어 널리 이용되고 있다. 색상별 키위의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 <Figure 1>과 같다. 시료 농도 1mg/mL에서는 17.52~22.73%의 소거능을 나타내었고 5 mg/ mL에서 33.56~52.05%, 10 mg/mL에서 57.67~75.15%로 농 도 증가에 따라 유의적인 증가추세를 보였다(p<0.05). 시료 추출물의 농도 20 mg/mL에서는 그린키위가 87.12%를 나타 내었으며 골드키위와 레드키위가 각각 92.29%와 94.83%로 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid의 94.47%와 대등한 소 거능을 보여주었다. Jeong et al.(2007)은 한국산 키위 열수 추출물의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 1.5~25 mg/ mL의 범위에서 농도 의존적으로 소거능이 증가하여 25 mg/ mL에서는 86.87%의 소거활성을 나타내었다고 보고하였다. 본 실험에서도 DPPH radical 소거능이 농도 의존적으로 증 가하였으며 레드키위가 다른 두 종의 키위보다 다소 우수한 것으로 나타났다.
3.ABTS radical 소거능
ABTS radical 소거능은 ABTS 용액과 potassium persulfate 용액 간의 반응에 의해 생성된 청록색의 ABTS cation radical (ABTS•+)이 시료 중에 존재하는 항산화 물질에 의해 제거되 면서 청록색이 탈색되는 점을 이용하여 측정하였다(Lee et al. 2011). ABTS radical 소거능은 DPPH radical 소거능 측 정원리와 같이 인위적인 radical을 제거하는 것이며 DPPH radical 소거능과 유의적인 상관성을 보인다는 보고가 있다 (Lee et al. 2011). 색상별 키위의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과는 <Figure 2>와 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서 는 9.41~15.14%로 그린키위가 유의적으로 낮게 나타났고 레 드키위가 가장 높게 나타났다(p<0.05). 추출물의 농도 증가 에 따라 소거능은 지속적으로 증가하여 5 mg/mL에서 22.90~ 40.52%, 10mg/mL에서 38.97~68.54%, 20mg/mL에서 63.38~ 99.57%를 나타내었다. 레드 키위는 모든 농도 범위에서 다 른 두 종류의 키위보다 높은 활성을 보여주었고 특히 20 mg/ mL 농도에서는 양성대조군인 ascorbic acid의 95.11%와 대 등하였는데 이는 다른 색상의 키위보다 레드키위의 폴리페 놀 함량이 높은 것과 관련이 있다고 하겠다. 또한 레드키위 의 과육에는 carotenoid, chlorophyll 색소 외에 안토시아닌 색소가 함유되어 있어(Montefiori et al. 2005) 항산화 작용 에 영향을 준 것으로 추측되나 좀 더 심층적인 연구가 진행 되어야 할 것으로 사료된다. Bursal & Gulcin(2011)은 키위 물 추출물의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 0~30 μg/ mL 범위에서 농도 의존적으로 증가하였다고 보고하여 본 실 험의 결과와 유사하였다. Jin et al.(2014)의 연구에서도 키위 n-hexane 분획물의 ABTS radical 소거 활성이 농도 증가에 따라 증가하는 경향을 나타내었다고 보고하였다.
4.Tyrosinase 저해 효과
Tyrosinase는 피부에 침착되는 색소인 melanin의 생합성에 관여하는 key enzyme이다. Melanin은 동물, 식물 및 미생물 에 널리 분포하는 고분자물질로 자외선에 의한 피부손상을 막아주는 중요한 역할을 하지만, 과잉으로 생성되는 경우에 는 점, 주근깨, 기미와 같은 미용적 문제를 야기시킨다(Jeong et al. 2007; Im & Lee 2014) 따라서 멜라닌 생성에 관여하 는 tyrosinase의 활성을 저해하는 것은 미백 기능성과 관련이 높기 때문에 식품업계 및 화장품업계에서는 천연물 유래의 tyrosinase 저해제에 대한 개발이 활발히 진행되고 있다. 색 상별 키위의 tyrosinase 저해 효과 측정 결과는 <Figure 3> 과 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 19.17~30.51%로 나타났 고 그 이후 증가추세를 보여 5 mg/mL에서 35.17~43.11%, 10 mg/mL에서 44.09~50.00%를 나타내었다(p<0.05). 시료 농도 20 mg/mL에서는 57.06~86.76%로 레드키위의 저해효 과가 가장 높게 나타났는데 이는 총 페놀함량이 높을수록 tyrosinase 저해 활성이 높게 나타난다고 한 연구 보고(Heo et al. 2013)와 일치하는 결과라 하겠다.
5.금속 킬레이트 효과
금속 킬레이트 효과는 ferrozine이 Fe2+와 반응하여 붉은색 을 띠게 되고 이 때 시료 추출물 중에 킬레이트 효과를 가진 성분이 존재하면 Fe2+-ferrozine 복합체 형성을 방해하여 발 색이 저해되는 원리를 이용하여 측정하였다(Gulcin I 2005). 색상별 키위의 금속 킬레이트 효과는 <Figure 4>에 나타난 바와 같이 시료 농도 1 mg/mL에서 19.24~39.63%를 나타내 었고 5 mg/mL에서 68.78~91.53%로 급격히 증가하였으며 특 히 레드키위는 90% 이상의 높은 효과를 나타내었다. 그 이 후 증가 추세는 둔화되어 10 mg/mL에서 74.00~95.27%, 20 mg/mL에서 80.57~95.65%를 나타내었다. 양성대조군으로 사 용한 ascorbic acid는 모든 농도에서 활성이 나타나지 않았는 데 이는 ascorbic acid가 Fe2+에 대한 킬레이트 효과가 없다 고 한 다른 연구보고와 유사한 결과이다(Yen et al. 2002; Chung 2014). 본 실험결과 Fe2+에 대한 킬레이트 효과는 골 드키위가 가장 낮았고 그린키위와 레드 키위가 우수한 것을 알 수 있었다.
6.환원력
환원력은 폴리페놀 화합물의 항산화 활성을 나타내는 지 표로 자주 이용되고 있다. 시료 추출물 중에 항산화력을 지 닌 환원성 물질이 존재하면 ferric ion (Fe3+)이 ferrous ion (Fe2+)으로 환원되면서 노란색에서 청녹색으로 변하게 되고 700 nm에서 최대의 흡광도를 가지게 된다. 이 때 흡광도 수 치가 높을수록 높은 환원력을 나타낸다(Terpinc et al. 2012). 색상별 키위의 환원력을 측정한 결과는 <Figure 5>와 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 0.07~0.14로 나타났고 시료 농도 증가에 따라 환원력은 점진적으로 증가하여 5 mg/mL에서 0.35~0.52, 10 mg/mL에서는 0.56~1.00으로 나타났다. 시료 농도 20 mg/mL에서는 1.43~1.82로 레드키위가 높은 환원력 을 보여주었는데 양성 대조군인 ascorbic acid의 환원력에는 미치지 못하였으나 다른 두 종류의 키위보다는 월등한 효과 를 보여주었다. Jeong et al.(2007)은 한국산 골드키위 열수 추출물의 환원력을 측정한 결과 1.5~50 mg/mL의 범위에서 0.27~3.21로 농도 의존적으로 환원력이 증가하였다고 보고하 여 본 실험의 결과와 유사하였다.
7.아질산염 소거능
육가공품 제조 시 거의 필수적으로 사용되는 아질산염은 육색의 발색 및 안정화, Clostridium botulinum균의 성장 억 제, 풍미 개선 등의 역할을 담당하지만(Macdougall et al. 1975; Park 2005) 과다 섭취할 경우에는 단백질 식품이나 의 약품에 존재하는 2급 및 3급 아민류와 반응하여 발암물질인 nitrosamine을 생성한다(Fiddler et al. 1973; Park 2005). 니 트로사민은 인체 내 위의 pH 영역에서 쉽게 생성되므로 산 성영역에서 니트로사민의 생성인자인 아질산염을 분해하는 효과 검색을 위해 색상별 키위의 아질산염 소거능을 측정한 결과는 <Figure 6>과 같다. 시료농도 1 mg/mL에서는 8.08~ 14.20%의 낮은 소거능을 나타내었으나 시료 농도가 증가함 에 따라 증가하여 5 mg/mL에서는 39.40~57.77%로 레드키 위가 가장 높은 소거능을 보여주었다. 시료 농도 20 mg/mL 에서는 골드키위와 그린키위가 각각 89.87%와 87.68%를 나 타내었고 레드키위가 97.88%를 나타내어 다른 두 종의 키위 보다 유의적으로 높은 소거능을 보여주었으며(p<0.05) 이는 ascorbic acid의 98.01%와 대등한 활성이었다. 아질산염은 페 놀성 물질에 의해 분해되어 nitroso화 반응이 억제된다고 보 고되고 있고(Lim et al. 2007) 본 실험에서 레드키위의 총 페놀 함량이 다른 색상의 키위에 함유되어 있는 총 페놀 함 량보다 높아 우수한 활성을 보인 것으로 사료된다. 이로써 레드키위 추출물은 nitrosamine의 생성을 효과적으로 억제하 여 항암작용에 기여할 것으로 기대된다.
IV.요약 및 결론
본 연구에서는 국내에서 생산되는 색상별 키위의 기능적 특성을 비교하기 위하여 총 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, tyrosinase 저해효과, 금속 킬 레이트 효과, 환원력, 아질산염 소거능 등을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 골드키위 3.09 mg GAE/g, 그린키위 2.71 mg GAE/g, 레드키위 4.59 mg GAE/g으로 나타났다. 레드키 위는 본 실험에서 조사한 항산화활성에서 골드키위나 그린 키위보다 우수한 효과를 나타내었고, 추출물의 농도가 증가 함에 따라 전반적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히 DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능 및 아질산염 소거능은 20 mg/mL의 농도에서 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 와 대등한 활성을 보여주었고 금속 킬레이트 효과는 ascorbic acid보다 우수한 효과를 보여 주었다. 이로써 레드 키위 추출 물은 총 페놀 함량이 높고 항산화능도 다른 색상의 키위보 다 높게 나타나 기능성 소재로써 활용될 가능성이 높을 것 으로 사료된다.
