I. 서 론

전 세계에 분포하고 있는 조류(藻類, algae)는 약 6,000여 종으로 알려져 있으며 그 중 150여 종이 식품으로 이용되고 있다(Devi et al. 2011;Meenakshi et al. 2012). 조류는 해 양생태계의 기초 생산자인 식물플랑크톤이라 불리는 단세포 성 미세조류(microalgae)와 광합성 색소에 따라 녹조류(green algae), 홍조류(red algae), 갈조류(brown algae)로 나뉘는 다 세포성 거대조류(macroalgae)로 분류되며 이를 통상 해조류 (seaweed)라고 부른다. 여기서 채취, 분리하여 추출된 2,400 종 이상의 물질은 오래전부터 인간에게 유용한 식용, 사료, 비료, 의약품, 공업용의 원재료 등으로 이용되어 왔다(Kumari et al 2011;Rath 2012).

최근, 의학기술의 발전과 생활수준의 향상은 인간의 수면 연장 및 건강증진으로 이어졌으며 신체의 대사과정에서 만 들어지는 활성산소에 대한 관심은 증대되었다. 활성산소는 노화 뿐만 아니라 암, 동맥경화, 당뇨병 등 각종 만성질환의 원인이 되므로 활성산소를 제거하는 방법에 대한 연구는 끊 임없이 이어지고 있다. 대표적으로 알려진 항산화제는 슈퍼 옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 카탈레이스 (catalase), 글루타티온 환원효소(glutathione reductase) 등의 효소 계열의 항산화제(Duh et al. 1999)와 합성 항산화제인 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸 하이드록시톨루엔(butylated hydroxy toluene, BHT) 등이 있 으며, 이들은 일부 식품에 허용되기도 하지만 안전성 문제로 사용량이 법적으로 제한되어 있다(Yen & Hsieh 1998). 천연 항산화제로는 페놀성 화합물인 토코페롤, 아스코르브산, 카 로티노이드, 글루타티온, 플라보노이드, 폴리페놀화합물 등이 보고되고 있으며(Larson 1988;Osborn-Barnes & Akoh 2003), 안전성이 보장되는 이런 천연 항산화물 탐색에 대한 중요도와 관심은 더욱 증가하고 있다.

해조류는 영양학적으로 풍부한 식이섬유, 비타민, 무기질, 필수아미노산, 불포화지방산을 함유하고 있고 특히 낮은 열 량과 함께 비소화성 점질성 다당류를 다량 함유하고 있다는 특징을 가진다(Jimenez-Escrig & Goni Cambrodon 1999). 해조류 중 갈조류는 전 세계적으로 약 1,500여 종이 발견되 었고, 해조류 중 가장 발달된 시스템을 가지고 있다고 알려 져 있다(Generalic Mekinic I et al. 2019). 갈조류에서는 피 코콜로이드(phycocolloid), 푸코이단(fucoidan), 플로로탄닌 (phlorotannins) 등의 생리활성 물질이 보고되었으며, 이들은 항응고, 항암, 항산화 등의 효과를 나타난다고 보고되었다 (Priya & Khora 2023). 갈조류 중 하나인 톳에서는 푸코잔 틴(fucoxanthine), 모자반에서 플로로탄닌(phlorotannin)이라 는 물질을 발견하였으며 그 외 황산기를 가진 다당류, 폴리 페놀 등의 화합물에서 항산화 효과가 있음이 보고되었다(Yan et al. 1998;Jimenez-Escrig & Goni Cambrodon 1999;Lim et al. 2002;Huang & Wang 2004). 육지와는 다른 환경의 바다는 50만 종 이상의 생물이 서식하고 있는 거대 한 생태계이나 접근성이 어려워 해양생물에 대한 연구는 걸 음마 수준이라 할 수 있다. 국내 식용가능 해조류는 약 50여 종으로, 지리적으로 풍부한 해양자원을 가지는 한국의 경우 세계 4위의 해조류 생산량을 가지고 있어 천연물 신약개발 의 원료로서 효과를 나타내는 생리활성 물질을 발견할 가능 성도 커 이를 이용한 적극적인 생리활성 연구 및 산업적 이 용 연구가 필요하다(Lee 2013;Choi et al. 2020).

전라남도는 국내 해조류 생산량 중 90% 이상을 차지할 만 큼 해조류의 주요 생산지로 본 연구는 전라남도에 분포되어 있는 해조류 16종을 대상으로 총 폴리페놀 함량을 측정하고 항산화능과의 상관성을 비교 분석하고 산화스트레스에 대한 해조류의 활성산소 억제능을 비교하여 향후 노화 예방 및 개 선 소재로서의 가능성을 검토하고자 하였다.

II. 연구내용 및 방법

1. 실험 재료 및 시약

본 실험은 전라남도 완도와 진도에 분포되어 있으며 식용 가능하고 구입이 비교적 용이한 자생해양해조류 중 갈조류 9종(넓패, 미역, 지충이, 톳, 쇠미역, 뜸부기, 괭생이모자반, 미 역귀, 다시마)과 홍조류 3종(세모가사리, 김, 참도박), 녹조류 4종(가시파래, 매생이, 청각, 파래)의 열수 추출물을 국립 목 포대학교와 전남 바이오산업진흥원 해양 바이오 연구센터로 부터 공급받아 10 mg/mL의 농도로 Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 실험에 이용하였다<Table 1>. 대조군은 추출물과 같은 농도의 DMSO를 사용하여 세포에 처리하였다. 분석에 사용된 시약인 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), Folin ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, sodium carbonate, hydrogen peroxide (H₂O₂) 30% 등은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터, 2', 7'-dichloro dihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Molecular Probes (Thermo Fisher Scientific, USA)에서 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)는 Duchefa (Biochemie BV, Haarlem, Netherlands) 에서 구입하여 실험에 사용하였다.

2. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis의 방법에 따라 측정하 였다(Folin & Denis 1912). 일정 농도의 해조류 추출물 20 L에 Folin-Ciocalteu’s reagent 0.1 mL를 첨가한 후 상온 에서 3분간 반응시켰다. 그 후 10% Na₂CO₃ 0.1 mL를 첨가 하여 교반한 다음 실온에서 1시간 동안 발색시켜 760 nm에 서 흡광도(TECAN Group Ltd., Shanghai, China)를 측정하 였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 0-1.0 mg/mL 농도의 gallic acid를 표준곡선으로 환산하여 계산하였으며 시료 g당 gallic acid의 mg equivalents (GAE mg/g)로 표시하였다.

3. 라디칼 소거능

라디칼 소거능은 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 소거 능 방법을 이용하였으며 Blois 방법(Blois 1958)에 준하여 측정하였다. 시료 추출물 100 mL에 에탄올에 용해된 0.2 mg/mL DPPH를 첨가한 후 혼합하여 실온에서 5분 동안 반 응시켰으며, 반응액은 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었다(Blois 1958).

4. 세포배양

신생아의 포피조직에서 분리한 인간 이배체 섬유아세포 (Human dermal fibroblast, HDF)는 서울대학교 의과대학 박 상철 교수로부터 공급받았다(Cho et al. 2004). HDF 세포 배양은 Dulbecco’s modified Eagle Medium (Welgene, Daegu, Korea)에 10% (v/v) fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)와 1% penicillin-streptomycin solution (Welgene)을 첨 가한 후 37°C, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였다.

5. 추출 시료의 세포독성평가

해조류 추출물을 세포 배양 배지에 희석하여 농도별로 처 리하였다. 시료의 세포 독성 평가는 MTT를 이용한 방법으 로 측정하였다(Vistica et al. 1991). 96 well plate (SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)에 1.0×10⁴ cell/mL의 농도 로 HDF 세포를 분주하여 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 24시간 안정화시킨 후 100 mg/mL 농도로 추출물을 처리하 여 24시간 배양하였다. 그 후 0.1 mg/mL MTT 시약을 처리 하고 생존 세포의 효소작용에 의해 환원되도록 2시간 더 배 양한 후 배양액을 제거하고 각 w ell에 2-propanol를 첨가하 여 생성된 formazan 결정을 녹인 다음 microplate reader를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. 항산화능 분석

세포 내 활성산소의 분석을 위해 산화 환원에 민감한 형 광 탐침 DCFH-DA를 사용하였다(Rosenkranz et al. 1992). 비형광물질인 DCFH-DA는 세포내에서 peroxides 존재 시 reactive oxygen species (ROS)에 의해 산화되면서 형광을 띄게 된다. HDF 세포를 96-well black plates (Corning, Corning, NY, USA)에 1.0×10⁴ cells/well의 농도로 분주한 후에 해조류 추출물을 100 mg/mL의 농도로 처리하고 24시 간 동안 배양하였다. 이후, 1.0 mM 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)를 1.5시간 동안 처리하여 산화적 스트레스 를 유도하고 10mM DCFH-DA를 처리한 후 빛이 들어가지 않도록 주의하여 37°C에서 30분간 반응시킨 뒤 세포를 DPBS로 3회 세척하였다. Fluorescent microplate reader (TECAN Group Ltd, Shanghai, China)를 사용하여 DCF (ex. 485 nm, em. 530 nm)에 의한 세포내 형광값을 측정하 였다.

7. 통계처리

상기의 모든 실험 결과는 3회 이상 반복 실험하였으며 모 든 실험값은 mean±SD로 나타내었다. 통계 분석은 SPSS 20.0 소프트웨어(IBM SPSS ver. 20.0 for Windows; IBM Co., Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행하였다. 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 실험 의 유의성 검증을 하였고, 유의성이 있는 경우 다중범위검정 (Duncan’s multiple range test)으로 사후 검정을 실시하였다 (p<0.05). 각 조사항목별 상관관계(p<0.05)를 알아보고자 총 폴리페놀 함량과 DPPH 자유라디칼 소거활성 양자 간의 피 어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)로 도출하여 비교하였다.

III. 결과 및 고찰

1. 국내 자생 해조류 추출물의 총 폴리페놀 함량과 항산화 효과

항산화 연구에서 식물을 중심으로 한 폴리페놀 함량과 항 산화 활성과의 연관성에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있 다(Liu et al. 2000;Tedesco et al. 2000). DPPH는 안정한 자유 라디칼 분자로 구성된 짙은 보라색의 결정성 분말로 라 디칼을 포함하는 화학 반응의 분석제이며, 일반적인 항산화 분석에 이용되고 있다. 자생 해조류 16종 열수 추출물의 항 산화 활성 분석을 위해 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능 실험을 하였고, 그 결과는 <Table 2>과 같다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 지충이(Sargassum thunbergii)가 128.02 mg/g로 가장 높은 함량을 보였고 다음으로 김(Porphyra tenera)이 50.67 mg/g 정도의 함량을, 그 다음으로 뜸부기 (Silvetia siliquosa) 46.53 mg/g, 톳(Sargassum fusiforme)은 40.36 mg/g의 함량을 보였다. 항산화능 측정에서는 DPPH 라 디칼 소거능 활성 정도를 IC₅₀ (mg/mL)값으로 비교한 결과 지충이(Sargassum thunbergii), 괭생이모자반(Sargassum horneri), 뜸부기(Silvetia siliquosa), 톳(Sargassum fusiforme), 다시마(Saccharina japonica), 김(Porphyra tenera) 순으로 효과를 보였다. 자생해조류 16종의 총 폴리페놀 함량과 항산 화 활성과의 Pearson 상관계수는 <Figure 1>에서와 같이 0.540 (p<0.05)로 유의적으로 상관성이 있는 것으로 나타났 다. 일반적으로 해조류 중 갈조류가 녹조류나 홍조류에 비해 높은 생리활성을 보이는 것으로 알려져 있다(Heo et al. 2005). 갈조류는 항산화능, 페놀성분, 티로시네이즈 활성 억 제능이 높아 산화적 손상을 줄이는데 주로 이용되며(Dang et al. 2018), 피부노화방지와 주름 방지등의 특성을 지녀 기능 성 화장품 소재로서도 제안된 바 있다(Shin & Kang 2021). 본 연구에서도 홍조류인 김을 제외한 지충이, 톳, 다시마, 괭 생이모자반 등의 갈조류에서 비교적 높은 폴리페놀 함량과 항산화능을 보였다.

2. 피부섬유아세포에서 국내 자생 해조류 추출물의 세포독성 반응

HDF 세포는 in vitro 노화 연구에 주로 사용하는 세포주로 서, 추후 항산화 효과가 탁월한 추출물의 노화억제 효과를 관찰하기 위하여 HDF 세포주를 이용하여 자생 해양식물 추 출물의 세포 독성을 평가하였다. 실험에 사용된 추출물을 100 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하고 MTT로 세포 생 존율을 확인하였다. 그 결과, 실험에 사용된 16종의 자생해 조류 추출물 100 mg/mL에서는 유의미한 세포 독성은 확인 되지 않았다<Figure 2>.

3. 피부섬유아세포에서 국내 자생 해조류 추출물의 산화스트 레스 억제 반응

HDF 세포에 H₂O₂로 산화스트레스를 유도 후 발생된 활성 산소를 자생 해조류 추출물이 제거할 수 있는지 여부를 조 사하였다. HDF세포에 H₂O₂를 1.0 mM 농도로 1.5시간 처리 하였을 때 세포 내 활성산소는 대조군에 비하여 1.6배 유의 적으로 증가하였다. 100 mg/mL 해조류 추출물로 전 처리 된 세포는 <Figure 3>에 제시된 바와 같이 지충이(Sargassum thunbergii), 김(Porphyra tenera), 다시마(Saccharina japonica) 순으로 세포 내 활성산소 생성을 효과적으로 억제하였다. 모 든 세포의 에너지 대사과정에서 산소는 필수적이며, 호흡을 통한 산소는 체내에서 산화과정 중 활성산소를 만든다. 적절 한 활성산소는 세포 내 신호 및 면역반응에 좋은 영향을 주 지만 과도한 생성은 세포 내 소기관들을 공격하여 질병을 유 발시킬 수 있다(Chiba et al. 2003;Bayr 2005;El-Beltagi et al. 2022). 유기체는 이러한 활성산소종의 조절을 위한 자 체 항산화 시스템을 가지고 있으나 다양한 요인에 의해 항 산화 시스템에 불균형이 생기면 결국 세포내 DNA 손상 및 돌연변이 등을 일으키게 되는 것이다. 따라서 불안정한 상태 의 활성산소를 제거하는 것은 세포손상 및 노화를 막는 핵 심이 될 수 있다(Halliday 2005). 갈조류에 속하는 지충이는 우리나라 전 연안 암반 조간대의 우점종이다. 제주도에서는 지충이가 톳의 경쟁해조류로 알려져 지충이 제거 연구에 집 중할 만큼 홀대를 받는 등 국내에서 크게 주목받지 못한 자 원 중 하나이지만, 다량의 점액성 다당류 성분과 함께 독특 한 물리적 성질을 지니고 있어 사료나 일부 안정제 및 증점 제로 활용되고 있다. 지충이의 생리활성에 대한 연구로는 항 균(Yi et al. 2001), 항염증(Kang et al. 2008), 항산화(Park et al. 2005) 효과 등이 보고되고 있으며, 분리된 단일 물질 로는 노리이소프레노이드 (norisoprenoid) 화합물들인 (+)- epiloliolide, (-)-loliolide 및 apo-9'-fucoxanthinone 등이 알 려져 있다(Park et al. 2004). 우리의 연구 결과, 지충이는 16종의 자생 해조류 중 항산화능이 가장 높았으며 인간섬유 아세포의 산화스트레스에 대한 가장 높은 억제 효과를 보였다.

IV. 요약 및 결론

본 연구의 목적은 자생 해조류 추출물 16종의 TPC와 항 산화능 및 인간섬유아세포에서 산화 스트레스 억제 효과를 비교하여 항노화 효과의 잠재적 가치를 평가하기 위함이다. 16개의 자생 해조류 중 총 폴리페놀 함량은 (TPC)는 지충이 >김>뜸부기>톳 순으로 높게 나타났으며 항산화능은 지충 이>괭생이모자반=뜸부기>톳>다시마>김 순서로 나타났다. 그리고 TPC와 항산화능 사이에 0.540의 Pearson 상관계수로 분석되었다. 이것은 해조류의 폴리페놀 함량과 항산화능과의 “상관성이 있다”는 것을 의미한다. 16종 자생 해조류 추출물 100 mg/mL 농도에서 유의미한 독성은 없었다. 과산화수소 유발 산화스트레스에 대한 보호능을 평가한 결과, 지충이가 가장 높게 활성산소 억제효과를 가짐을 알 수 있었다. 국내 해안가 연안에서 흔히 발견되는 갈조류 중 하나인 지충이는 자외선과 같은 열악한 환경 조건에서도 적응을 하며 증식해 온 해조류 중 하나이다. 또한 세포손상의 방어에 필요한 항 산화 물질을 분비하고 보습 효과, 항염증, 콜라겐 합성 촉진 효능을 가지는 점액질 다당체 등을 생성하는 등 자체 방어 기제(defense mechanism)를 구축하며 생명활동을 영위한 것 으로 알려져 있다. 비교적 산업화되지 않은 지충이와 같은 해조류의 자체 방어 성분을 활용할 경우, 다양한 분야에서 고부가 가치를 지닌 항산화 기능성 소재 개발에 기여할 수 있을 것으로 예상한다.