I 서 론

당뇨병은 경제성장과 이로 인한 생활양식의 변화 및 도시 화로 인한 비만인구의 증가와 함께 빠르게 증가되고 있는 질 병으로 국제 당뇨병 연맹에 따르면 2014년 3억 8천명에서 2035년에는 5억 9천명으로 증가할 것으로 예측하고 있다 (Donath MY 2014). 국내 당뇨병 유병률은 꾸준히 증가하여 2016년 만 30세 이상 성인 전체의 약 11.3%가 당뇨병 유병 자였다(http://kosis.kr).

당뇨병의 만성 합병증은 주로 혈관의 병변에 기인하며 대 혈관병증 및 미세혈관병증으로 구분된다. 대혈관병증은 동맥 의 죽상경화증에 의한 관상동맥질환(coronary artery disease), 뇌혈관질환(cerebrovascular disease) 및 말초혈관질환 (peripheral vascular disease)을 들 수 있다. 미세혈관병증은 당뇨병성 망막병증(retinopathy), 신장병증(nepropathy) 및 신 경병증(neuropathy) 등이 있다. 이러한 합병증은 세포의 산화 적 손상에서 기인한 것으로 포도당의 자가산화 혹은 미토콘 드리아에서 생성된 산소 유리기가 세포의 산화적 손상의 주 요한 요인으로 꼽히고 있다(West et al. 1983).

Framingham 연구(Garcia et al. 1974)에서 당뇨병환자는 심장질환으로 인한 사망이 많다고 보고한 이래 당뇨병환자 중 약 80%는 대혈관 합병증으로 사망하며, 이 중 70% 정도 는 관상동맥 질환이며 나머지는 뇌혈관 질환과 말초혈관 질 환에 의한 것으로 당뇨병성 심혈관계 질환이 당뇨병의 이환 율 및 사망률과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있다(Kim YJ 2000). 당뇨병에서는 중성지방, VLDL (Very Low Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein), 총 콜레스 테롤 함량의 증가 및 HDL (High Density Lipoprotein)-콜 레스테롤의 감소 등의 이상지혈증(dyslipidemia)의 발병이 정 상인에 비해 2-4배 정도 높으며(Kakkar et al. 1995; Reaven 1987; Brownlee et al. 1984), 이는 주요 만성 합병 증인 관상동맥질환의 위험인자로 확인되었다(West et al. 1983). 정상 세포는 유리기의 생성과 항산화 방어 시스템이 균형을 이루고 있어 세포 손상이 있어나지 않으나(Jacob RA 1995) 당뇨병은 체내 유리기가 과다 생성되고(Ceriello et al. 1992) 이를 방어하는 항산화 방어 시스템의 기능이 감소되어 균형이 깨지고, 이로 인해 과도한 산화적 스트레스가 발생하 게 된다(Evans et al. 2002; Monnier et al. 2006). 과도한 산화적 스트레스는 당뇨병 합병증의 원인이 되는 세포내 지 질 과산화물 생성을 증가시킨다(Baynes et al. 1999). 당뇨병 의 합병증들은 일단 진행되고 난 후에는 고식적, 대증적 치 료 이외의 치료방법이 없기 때문에 합병증의 발생기전 및 병 태 생리를 밝혀 사전에 위험요인을 차단함으로써 치명적인 말기 합병증으로의 진행을 예방하거나 지연시키는 것이 중 요하다.

2016년 농작물 생산 통계에 따르면(Kostat 2017), 국내 자 두 재배 면적과 생산량은 경북지역이 각각 85.3, 87.1%를 차 지하며, 특히 김천지역은 국내 재배 면적의 16.3%, 생산량의 12.4% (GATC 2017)로 국내 최대 생산지 중 하나이다.

자두의 화학성분 조성은 품종 및 재배환경에 따라 차이는 있으나 구연산, 사과산 등의 유기산과 과당(Kim et al. 2000), 페놀성 phytochemical인 neochlorogenic acid, rutin 및 anthocyanin 등을 풍부하게 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(Kim et al. 2003; Donovan et al. 1998). 이러한 페놀 성 phytochemical은 높은 항산화능(Wang et al. 1996) 및 항알러지, 항균, 항염증 효과(Kim et al. 2000; Eberhardt et al. 2000), 항변이원성 및 항암 효과가 있으며, 페놀성 phytochemical이 많이 함유된 식품을 지속적으로 섭취하면 심혈관질환과 심장병의 위험도를 감소시킨다고 한다(Knekt et al. 1996). 국내산 자두 품종의 생리활성에 관한 연구로는 생육시기에 따른 피자두의 항산화 효과(Yu et al. 2004), 돌 연변이 억제작용(Ham et al. 1987), 항암작용(Kim et al. 2013), 아질산염 소거능(Lee et al. 2000), 식중독 균 저해효 과(Lee et al. 2003) 등이 보고되어 있을 뿐이다.

World Health Organization (WHO 2003)에 의하면 당뇨 병은 환자의 적극적 자가관리로 합병증을 예방하고 삶의 질 향상에 기여할 수 있다고 한다. 당뇨병은 높은 혈당을 조절 하면서 체내의 항산화능을 향상시키는 것이 혈당 뿐 아니라 합병증의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 보고되고 있어 (Jones et al. 2003), 최근 연구에는 항산화능이 높은 천연 기 능성 물질을 이용한 당뇨병 치료 및 합병증 예방 연구가 활 발히 진행되고 있다.

따라서, 본 연구에서는 항산화작용이 높은 페놀성 phytochemical들이 풍부한 자두의 섭취가 1형 당뇨 유발 흰쥐의 전 반적 대사, 혈당, 혈장 지질, 과산화지질 형성에 미치는 영향을 조사하여 만성 합병증 예방에 미치는 효과를 알아보려 한다.

II 연구 내용 및 방법

1 자두의 이화학적 분석

김천산 자두는 2011년 7월의 피자두를 열풍건조하여 분말 화한 것을 사용하였고, 한국식품연구원에 의뢰하여 일반성분 분석은 AOAC법(AOAC, 1990)에 따라 수분은 상압가열건 조법, 지방은 soxhlet 추출법, 단백질은 Kjeldahl법, 회분은 회분시험법, 탄수화물은 계산법, 식이섬유는 총 식이섬유 시 험법에 따라 분석하였다<Table 1>.

2 실험동물의 식이제조 및 사육

실험동물은 7주령의 Sprague-Dawley종 흰쥐 수컷(Central Lab animal, Korea)을 항온항습 기능이 있는 사육실(기온 23±3oC, 습도 55±15%, 12시간 dark/light cycle)에서 적응기 2주간 pellet으로(Jeil animal feed Co., Korea) 평균 체중이 300 g이 될 때까지 사육하여 난괴법으로 정상대조군은 8마 리, 당뇨군들은 12마리가 되도록 4군으로 나누었다. 실험군 의 분류는 정상 대조군, 당뇨 대조군, 당뇨-10% 자두분말군 (Diabetes-low plum), 당뇨-20% 자두분말군(Diabetes-high plum)으로 구성하였다. 실험식이 급여기간은 6주였으며 당뇨 군들은 실험식이 시작 직전 1형 당뇨를 유도하였으며 실험 기간 동안 모든 군들은 식이와 물을 자유로이 섭취하도록 하 였다. 실험식이의 구성은 <Table 2>와 같으며 AIN-76 식이 를 기본으로 하여 isocaloric diet로 당뇨-10% 자두분말군에 게는 식이의 10%를, 당뇨-20% 자두분말군에게는 식이의 20%를 자두분말로 공급하였다.

식이효율은 일정기간의 식이섭취량을 그 기간 동안의 체 중증가량으로 나눈 것으로 실험식이 3주째에서 5주째에 걸 쳐 14일간 실시하였다.

3 당뇨 유발

실험식이 급여 시작 3일 전 당뇨군의 동물에 streptozotocin (Sigma, USA)을 0.1M citric acid buffer (pH 4.5)용액에 용해시켜 대퇴부 근육에 주사(50 mg/kg BW)하여 당뇨병을 유발하였으며 정상군은 동량의 citric acid (0.1 M, pH 4.5) 용액을 주사하였다. 주사 48시간 후 꼬리 정맥의 정맥혈로 혈당을 측정(New Accu-Check Active, Roche, Germany)하 여 공복시 혈당이 126 mg/dL 이상일 때 당뇨병이 유발된 것 으로 간주하였다. 실험식 투여 3주째에 공복시 혈당을 측정 하여 당뇨상태가 유지되고 있음을 확인하였다.

4 혈당 관련 인자

1) 공복혈당(fasting plasma glucose)

최소한 8시간 금식 후 꼬리 정맥에서 측정한 혈당농도 (plasma glucose)를 2주에 한번 측정하였다.

2) 당화혈색소(glycated hemoglobin, HbA1c)

희생시 채혈한 전혈(whole blood)을 ELISA (enzyme linked immunoabsorbant assay) kit (Crystal Chem, USA. Cat No. 80300)를 이용하여 분석하였다.

3) 공복 혈장인슐린(fasting plasma insulin concentration) 농도

희생시 채혈한 혈액의 혈장을 분리하여 ELISA kit (Crystal Chem, USA. Cat No. 90010)를 이용하여 분석하였다.

5 실험동물 해부

희생전날 밤 실험동물을 12시간 절식시킨 후 ethyl ether로 호흡 마취시킨 후 개복하였다. 복부 정맥에서 채취한 혈액을 혈장 분리하여 −70oC 냉동고에서 보관하였다. 혈액을 채취 한 다음 장기를 적출하여 지방을 제거하고 생리 식염수로 헹 군 후 수분을 제거하여 무게를 측정하였다.

6 혈액 분석

1) 중성지방(triglyceride, TG)

혈장 중성지방(Triglyceride; TG)은 Muller법을 이용한 kit (AM 157S-K, Asan Pharmaceuticals, Korea)를 사용하여 흡광도 550 nm에서 측정하여 정량하였다.

2) 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC)

혈장 총 콜레스테롤(Total cholesterol; TC)은 Richmond법 을 이용한 kit (AM 202-K, Asan Pharmaceuticals, Korea) 를 사용하여 흡광도 500 nm에서 측정하여 정량하였다.

3) HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol, HDL-C)

HDL-cholesterol (HDL-chol)은 Finley법을 이용한 kit (AM 203-K, Asan Pharmaceuticals, Korea)를 사용하여 흡 광도 500 nm에서 측정하여 정량하였다.

4) HDL-C/Total-C ratio

총콜레스테롤 농도 당 HDL-C의 비율은 다음 수식에 의해 산출한다.

HDL-C/Total-C (%)=(HDL-C/Total-C)×100

5) 동맥경화지수(Atherogenic index, AI)

동맥경화지수(Atherogenic index; AI)는 다음 공식에 의해 계산한다.

AI=(Total-Chol)−(HDL-Chol)/HDL-Chol

7 간의 과산화물질 분석

간조직 중 과산화물질(Thiobarbituric acid-reactive substances; TBARS) 측정방법은 다음과 같다. 0.5 g의 조직에 9배 부피 의 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)를 넣어 균질 화 한 후 0.5 mL을 취해 20 mL screw capped tube에 넣어 1% phosphoric acid 3 mL과 0.06 M TBA용액 1 mL을 첨 가하여 끓는 물에서 45분간 방치한 후 실온으로 식힌다. 이 혼합물에 n-butanol 4 mL을 첨가하여 3000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 butanol 층을 취해서 535 nm에서 흡광도를 측정한다. Malondialdehyde (MDA) 표준용액은 tetramethoxypropane (TMP)을 가수분해하여 조제하였다. 즉 TMP 1 mmol을 100 mL의 0.01 N HCl 용액에 녹여 50°C water bath에서 60분간 가열한 후 실온으로 냉각시켜 가수분 해된 TMP용액 1 mL을 0.01M Na₃PO₄ (pH 7.0) buffer 100 mL에 희석시켜 MDA 표준용액(1×10⁻⁴ M)을 만들었다. MDA 표준용액의 흡수 스펙트럼을 얻어 λmax (267 nm)에 서의 흡광도와 MDA의 extinction coefficient로부터 정확한 농도를 계산하였다. TBA-MDA chromopore의 표준곡선은 MDA 표준용액을 혈장과 동일한 조건에서 반응시켜 산출하 였으며 TBA 반응물질의 양을 MDA equivalent로 산출하였 다. TBARS의 양은 조직 wet weight g을 기준으로 계산한다.

III 결과 및 고찰

1 실험동물의 식이제조 및 사육

1) 식이효율

식이효율은 <Table 3>과 같으며, 정상군이 0.26으로 가장 높고 당뇨군들은 모두 정상군에 비해 낮은 값을 보였다. 그 러나 자두 공급군들은 당뇨군 0.17에 비해 10% 공급군은 0.20, 20% 공급군은 0.22로 높은 값을 보였다. 2주 동안 이 루어진 식이효율 측정에서 당뇨군들의 체중증가와 식이효율 이 낮은 것은 Brook et al.(1989)이 streptozotocin (STZ)으 로 당뇨를 유발한 쥐는 체중이 급격히 감소하며 체중 회복 이 쉽지 않다고 발표한 연구결과를 뒷받침한다. 당뇨군들 중 에서 자두공급 당뇨군은 당뇨군에 비하여 높은 식이효율을 보였는데 이는 1형 당뇨 동물모델을 대상으로 한 실험에서 식이효율이 높은 군들에서 당뇨병의 대사 개선에 효과가 있 다는 연구결과(Lee et al. 2004; Nial et al. 1990)와 연관 지어볼 때, 자두의 투여가 당뇨병 동물의 전반적 대사 개선 에 기여할 수 있을 가능성을 유추할 수 있게 한다.

2 혈당측정

1) 공복혈당(fasting plasma glucose)

공복시 혈당은 <Table 4>에 나타내었다. 정상 대조군은 실 험식이를 시작하는 시기의 공복시 혈당의 평균이 97.86 mg/ dL이나, 당뇨군들은 284.64-298.27 mg/dL의 수준이었다. 6주 간의 실험식이 공급 후 당뇨-고자두군의 공복시 혈당이 다른 당뇨군들에 비해 유의하게 낮아지는 변화를 보였다. 이는 2 형 당뇨 실험 동물을 대상으로 한 연구(Utsunomiya et al. 2005; Kadowaki & Yamauchi 2005)에서도 자두의 급여가 공복시 혈당을 낮추어준다는 연구결과와 일치함을 보였다.

2) 당화혈색소 (Glycated hemoglobin, HbA1c)

Hemoglobin의 당과의 결합 상태를 판별하는 HbA1c는 당 뇨상태에 있어서 hemoglobin의 반감기동안의 혈당변화를 반 영하므로 반감기인 17-20일 동안의 혈당변화를 반영하는 수 치이다. <Table 5>에 나타낸 바와 같이 정상군의 HbA1c값 은 3.00%이나 당뇨군은 8.24%에 달했으며 자두를 식이의 10% 공급한 군은 7.08, 20% 공급한 군은 6.70%로 자두의 급여가 당뇨병의 식이로 인한 혈당 상승을 억제하여 고혈당 상태가 줄어들어 HbA1c 값이 줄어든 것으로 보인다. 시판 자두제품의 식이섬유 함량(Han et al. 2008) 및 기능성, 한국 산 자두의 품종을 화학적으로 분석한 연구에서(Jung et al. 2005) 자두는 불용성 및 수용성 식이섬유가 풍부함이 발표되 었다. 실험 동물을 대상으로 여러 과일, 채소의 섭취에 따른 저혈당 효과 연구(Survay et al. 2010)에서 과일중에서는 탠 저린, 자두, 배가 저혈당 효과를 보인다는 연구결과를 얻었 다고 한다. 이를 모두 고려하면 자두에 풍부한 식이섬유원이 혈당의 상승을 억제하여 당화혈색소의 형성을 줄이는 것으 로 유추할 수 있다.

1형 당뇨환자의 만성 합병증에 관한 연구(Diabetes control and complication trial 1993)에서는 당화혈색소를 약 1.0% 낮추면 망막병증의 진행은 절반가량 감소한다고 보고하였으 며, United Kingdom Prospective Diabetes Study(1998)에 서도 당화혈색소를 1.0% 감소시키면 미세혈관 합병증은 37%, 심경경색은 14% 감소된다고 보고하였으므로 당화혈색 소 생성을 억제하는 것이 당뇨환자의 만성 합병증 예방에 매 우 중요한 요소임을 알 수 있다.

4) 혈장인슐린 농도

혈장인슐린 농도는 군들 사이의 유의한 차이는 없었다 <Table 6>. 이는 streptozotocin으로 유도된 1형 당뇨병의 경 우 췌장 랑게르한스섬의 β-cell을 파괴하여 인슐린 분비가 되 지 않으므로 이이 대한 재생이 일어나지 않는 한 농도의 차 이가 없을 것으로 추정할 수 있다. 이로써 자두의 공급이 인 슐린 자체의 농도를 높이는 효과는 없는 것으로 볼 수 있다.

3 장기무게

간, 신장의 무게는 체중에서 오는 장기무게의 차이를 최소 화하기 위해 각 장기를 체중 100 g 당 무게로 환산하였으며 간, 신장의 무게는 당뇨군들이 정상 대조군에 비해 높게 나 타났다<Table 7>. 간의 단위 체중 당 무게는 정상 대조군에 비해 당뇨군이 증가되었는데 이는 인슐린 수준의 저하로 당 질대사가 정상적으로 일어나지 않고 대신 체지방이 분해되 어 유리지방산이 다량 혈액으로 방출되면서 간에서의 중성 지질합성이 증가됨으로서 초저밀도 지단백으로 중성지방 분 비가 억제되어 간장 내에 축적되기 때문인 것으로 보고되었 다(Stone & Van 1985). 당뇨대조군들의 단위 체중 당 신장 의 무게도 증가함을 볼 수 있다. 당뇨는 포도당이 오탄당인 산회로에 의해 glucose flux를 증가시키고(Barzilai & Rossetti 1993) 신사구체 여과율의 증가와 함께 사구체 기저막의 비후 와 사구체 간질의 팽창 등으로 인해 신장의 크기와 용적이 증가하는 병태적 특징 때문인 것으로 볼 수 있다(Gallaher et al. 1993). 본 실험에서는 간의 단위체중 당 중량은 유의한 차이는 없으나 자두를 공급함에 따라 감소하는 경향을 보였 으며, 자두 공급군들의 신장의 단위체중 당 중량이 당뇨군에 비해 유의하게 낮게 나타났는데, 이는 자두의 급여가 당뇨병 으로 인한 비알콜성 지방간과 신증의 예방에 유익한 효과를 나타낼 가능성을 보여준다.

4 혈액 분석

혈장 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 수준, 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 수준은 <Table 8>과 같 다. 혈장 중성지방 수준은 정상 대조군과 모든 당뇨군들에서 유의한 차이가 없었다. 혈장 총 콜레스테롤 수준은 정상 대 조군에 비해 모든 당뇨군들의 수준이 유의하게 높았으며 당 뇨군들 사이에서는 당뇨대조군에 비해 자두공급군들의 수준 이 유의하게 낮았다. 혈장 HDL-콜레스테롤 수준은 정상대조 군이 당뇨군들에 비해 유의하게 높은 값을 보였으며 당뇨군 사이에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 혈장 총 콜레스테 롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비는 당뇨군들이 정상대조군 에 비해 모두 유의하게 낮은 값을 보였으며 자두공급군들은 당뇨대조군에 비하여 유의하게 높은 비를 보였다. 동맥경화 의 위험지표인 동맥경화지수(AI)는 정상 대조군이 당뇨군들 에 비해 유의하게 낮았으며 당뇨대조군이 유의하게 가장 높 은 수준이었으며 자두공급군들이 유의하게 그 다음 수준이 었다.

당뇨병에서 혈청지질과 지단백이상은 당뇨병 환자의 만성 합병증 중 가장 높은 사망원인이 되고 있는 죽상경화성 질 환의 발생에 주된 역할을 하고 있다(Fredrick 1990). 당뇨상 태에서는 간의 hydroxymethyl glutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase 활성이 감소하고 장의 HMG-CoA reductase의 활 성이 증가하는데, 이로 인해 장내의 콜레스테롤 이동이 증가 하여 고콜레스테롤혈증이 나타나며(O’meara 1990), 체내 인 슐린의 저하는 비정상적인 당질대사를 이끌어 체지방이 분 해되면서 유리지방산이 다량 혈액으로 방출되어 고중성지질 혈증이 나타나는 것으로 알려져 있다(Syvanne et al. 1995). 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증과 혈중 HDL-콜레스테롤 수준의 감소는 당뇨환자의 혈관계질환의 발병률을 정상인에 비해 2-4배 이상 높이며 이들 질환은 당뇨병으로 인한 사망 의 75-80%를 차지한다고 보고된 바 있다(Syvanne et al. 1995). 혈중 중성지질의 양은 특별한 감소 양상이 보이지 않 았으나 총 콜레스테롤의 수준과 총콜레스테롤에 대한 HDL- 콜레스테롤의 비는 당뇨 대조군에 비해 자두 급여군들이 유 의하게 낮은 수준을 보였다. 동맥경화의 위험도를 보여주는 AI지수도 당뇨대조군에 비해 자두 공급군들이 유의하게 많 은 차이가 나면서 감소하여 당뇨병에서 가장 문제가 되는 합 병증인 동맥경화의 예방을 시사해준다.

5 간의 과산화물질 분석

간조직 중의 지질과산화물 함량은 <Figure 1>과 같다. 간 조직 중 지질과산화물 수준에서 당뇨군들이 정상 대조군에 비해 유의적으로 높은 값을 보였다. 당뇨군들 사이에서는 당 뇨대조군이 가장 유의하게 높았으며 유의하게 자두 10% 공 급군, 자두 20% 공급군의 순이었다. 산화적 스트레스는 당 뇨병 및 이와 관련된 다양한 합병증 발병에 관여한다 (Brownlee et al. 2001). 당뇨병에서 산화적 스트레스를 증가 시키는 요인으로는 비효소적 당화(nonenzymatic glycosylation) 와 자동산화적 당화(autoxidative glycosylation)의 증가, 에너 지 대사의 변화에 기인한 대사 스트레스의 증가, 솔비톨에 기인한 국소적 손상 등이 거론되고 있다(Nourooz et al. 1997). 또한 산화적 스트레스는 지방간, 고혈압(Nakazono 1991) 및 동맥경화(Ohara 1993)등의 당뇨 합병증의 발병을 증가시키는 것으로 보고되었다. 따라서 산화적 스트레스를 낮추는 것은 인슐린 분비와 인슐린 감수성을 개선하여 당뇨 병의 합병증을 예방하는 효과가 있을 것이다. 당뇨병에서의 이러한 지질과산화물의 증가는 LDL-콜레스테롤을 산화시켜 동맥경화증의 혈관변화를 가속화시킨다고 알려져 있다(Addis et al. 1991). 본 실험의 결과, 당뇨군들의 간조직 TBARS 수준은 정상 대조군과 유의한 차이가 있었으며 자두의 급여 는 지질과산화물의 생성을 유의하게 낮추었다. 이는 자두와 인이 실험동물의 지질대사 및 지질과산화에 미치는 영향에 대한 연구(Yoon et al. 2008)의 결과와도 일치하며 이는 자 두의 페놀성 항산화물질들이 작용한(Kim et al. 2003; Kim et al. 2000; Yu et al. 2004) 것으로 사료된다. 또한 자두가 조직의 지질과산화에 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 보여 주며 이로 인해 당뇨병의 만성 합병증의 예방에 효과가 있 을 것을 시사한다.

IV 결론 및 요약