I.서 론
전 세계적으로 암 발병률은 향후 20년간 57% 증가할 것 으로 예상되며, 특히 저소득 국가나 저소득층에게 더 큰 위 협이 될 것으로 예상되고 있다(Torre et al. 2015). 이러한 암을 치료하기 위해서 주로 외과적인 수술과 항암제를 사용 하고 있으나, 외과적인 수술은 발병 부위에 따라 그 범위가 제한적이고 항암제 역시 부작용의 영향으로 한계점을 보이 고 있다. 이러한 이유로 자연식품을 섭취함으로써 암 발병을 줄일 수 있는 다양한 방법이 연구되고 있으며(Vanamala 2017), 2014년 세계 암 보고서에서는 식물에 기초한 음식이 암을 포함한 다양한 만성 질환을 예방할 수 있을 것으로 제 시하였다(IARC 2014).
최근 자연식품을 이용한 건강법 중 일상생활에서 쉽게 섭 취할 수 있는 당근, 무, 무청, 우엉 및 표고버섯을 재료로 하 여 열수추출한 복합식물추출물이 고혈압, 당뇨 및 암에 효과 가 있다고 보고되었고(Jeon 2006), 국내에서도 이에 대한 효 능 연구가 진행되어, RAW264.7 세포에서의 NO 생성, iNOS 발현 정도, 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 분비량 측정을 통해 항염증 효과가 있다는 것이 보고되기도 하였다(Sim et al. 2010). 이러한 복합식물 추출물은 국내에서 ‘야채수프’ 혹은 ‘해독주스’로 알려져 암, 성인병 및 아토피 환자에게 많은 관심을 불러 일으키며 다양한 제품이 판매되고 있는데(Park & Park 2016), 이름 과는 달리 여러가지 식물을 열수추출한 맑은 액상의 추출액 으로서 일반적으로 알려져 있는 수프와는 다른 형태를 띠고 있다.
복합식물추출물인 야채수프의 다양한 효과는 식물성 재료 의 복합적인 작용에 기인한 것으로 판단되는데, 당근의 주성 분인 β-carotene은 비타민A의 전구체로(Heinonen 1990) 활 성산소 생성억제를 유도하여 노화 및 암을 억제하는 작용이 있으며(Weisburger 1991), 무청의 glucosinolate는 암세포의 cell arrest 및 apoptosis를 유도하고(Dinkova & Kostov 2012). 우엉의 lignan은 암 생성 및 암 조직의 혈관 형성 억 제 효과가 있다(Luo et al. 2017). 특히, 표고버섯의 lentinan 은 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cells), 호중 성구(neutrophils), 자연살해세포(natural killer cells), 림프구 (lymphocytes) 등 다양한 면역세포의 활성화를 자극하고, β- glucan은 대식세포를 자극하여 면역에 관련된 사이토카인 분 비를 촉진시킴으로써 면역 중추 세포인 B세포와 T세포 활성 화에 영향을 준다고 알려져 있다(Ina et al. 2013).
야채수프에는 이렇게 다양한 생리활성성분이 존재하는데, 기존에 사용 중인 재료 외에 기능성 성분이 포함된 새로운 재료를 추가하면 복합식물추출물인 야채수프의 기능을 강화 할 수 있다. 특히, 둥굴레에는 면역 활성화를 유도하는 사포 닌과 알칼로이드 성분이 포함되어 있고(Zao & Li 2015), 옥 수수에는 플라보노이드 성분이 항암 기능을 나타낸다고 보 고되었다(Lee et al. 2014). 또한 레몬, 감귤의 경우에도 비타 민 C, 토코페놀, 카로티노이드, 페놀성 화합물과 같은 이차 대사산물이 존재하는데, 이들 역시 높은 항산화 활성을 나타 내는 것으로 항암 효과를 가진다고 보고되어 있다(Lee et al. 2013). 따라서, 기존의 야채수프에 이러한 성분이 추가되면 기능이 증진된 새로운 제품을 개발할 수 있다. 또한, 야채수 프의 일반적인 제조방법은 식물성 재료인 당근, 무, 무청, 우 엉 및 표고버섯을 물에 넣고 가열한 다음 추출하는 방법인 열수추출을 이용하고 있는데, 야채수프 제조시 단순히 열수 추출만을 이용하는 것보다 추출 전에 덖음이나 압출성형공 정을 적용한 후 추출하면 다양한 생리활성작용이 있는 식물 성 재료의 폴리페놀이나 플라보노이드의 추출 수율 증가를 기대할 수 있다(Sung et al. 2016).
따라서, 본 연구에서는 야채수프의 기능성 강화를 위하여 둥굴레, 옥수수, 레몬, 감귤과 같은 새로운 식물성 재료를 추 가하고, 기존의 야채수프 제조공정에 덖음과 압출성형 공정 을 적용하여 4종의 개량된 야채수프를 제조하였다. 기존 야 채수프의 재료 중 무청은 압출성형공정을 적용하고 우엉은 덖음공정을 적용하여 제품을 개발하였고, 둥굴레, 옥수수, 레 몬 추출물, 감귤 추출물과 기호성 조절을 위한 설탕을 각각 다른 배합비로 첨가한 다음, 각 개발 제품의 생리활성작용을 살펴보고자 하였다. 개량된 야채수프의 기초적인 생리활성작 용은 CT26 마우스 대장암 세포주에 대한 항암 및 면역 활 성을 비교하여 평가하고자 하였다. 항암효과는 암세포에 대 한 세포독성 및 apoptosis 유발 비율을 비교하여 평가하였고, 면역 활성은 비장세포 증가율과 암세포와 비장세포의 공배 양시 암세포의 사멸정도 및 비장세포에 의해 생성되는 사이 토카인의 양을 측정하여 항암효과와 면역력 증가에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
II.연구 내용 및 방법
1.실험재료
본 실험에 사용한 야채수프의 원료는 유기농법을 이용하 여 무농약으로 재배된 무, 당근, 무청, 우엉, 표고버섯, 둥굴 레, 옥수수, 레몬 추출물, 감귤추출물 및 설탕을 사용하였다. 무청, 표고버섯, 둥굴레 및 옥수수는 자연 건조된 것을 사용 하였고, 무, 당근 및 우엉은 건조하지 않은 상태로 사용하였 으며, 각각 세척 등의 전 처리를 거친 다음, <Table 1>의 비 율대로 혼합한 후 환류순환추출기(Dongbang Machinery Co., Korea)를 이용하여 100°C에서 1시간 동안 순환 열수추 출하여 추출액을 이용하였다. 레몬 추출액, 감귤 추출액 및 설탕은 추출액에 첨가하여 혼합한 후 최종적인 야채수프를 제조하였다.
개량한 야채수프를 제조하기 위하여 무청은 압출성형하여 사용하였고, 우엉은 덖음공정을 거쳐 사용하였다. 무청의 압 출성형 공정에 사용된 압출성형기는 스크류 직경이 29.0 mm, 직경과 길이의 비(L/D ratio)가 25:1인 자체 제작한 실 험용 쌍축압출성형기(THK 31T, Inchon Machinery Co., Incheon, Korea)를 사용하였고, 원료사입량 및 사출구 직경 을 각각 100 g/min, 3.0 mm로 고정한 다음, 선행연구에서 최 적조건으로 설정된 수분함량 20%, 스크류 회전속도 250 rpm, 배럴 온도 130°C의 조건에서 무청을 압출성형하여 사 용하였다(Sung et al. 2016).
우엉의 덖음 처리는 45°C에서 약 20~22시간 동안 건조하 여 수분함량이 약 14%가 되도록 한 후, 진공압력 볶음기로 250~300°C(압력 0.22~0.3 MPa)에서 17분 동안 덖은 후 우 엉의 온도가 실온과 같이 떨어질 때까지 실온 방치 한 후 열 수 추출에 사용하였다.
야채수프1은 일반적인 방법대로 무, 당근, 무청, 우엉 및 표고버섯을 열수추출하여 제조하였고, 야채수프2~5는 개량 한 제품으로서 무청과 우엉은 각각 압출성형과 덖은 후에 이 용하였고, 배합비에 따라 둥굴레와 옥수수를 추가하여 열수 추출한 다음, 최종적으로 레몬 추출물, 감귤 추출물, 설탕을 첨가하여 제조하였다. 본 실험에 사용된 야채수프의 제조를 위한 재료의 구성비율은 <Table 1>과 같다.
2.세포 배양 및 시약
본 연구에서 사용한 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 정상세포로는 3T3 세포주를 사용하였고, 암세포로는 마우스 대장암 세포주인 CT26 세포주를 사용하였다. 비장세포는 암컷 Balb/c mouse (Orient Bio Inc., Korea)에서 적출한 비장에서 분리한 비장 세포를 사용하였다. 세포주 배양을 위한 배지로 3T3 세포는 DMEM (Welgene, Korea), CT26과 비장세포는 RPMI1640 media (Welgene, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS) 을 첨가하여 사용하였고, 세포주를 37°C, 5% CO2 배양기에 서 배양하여 실험에 사용하였다. 세포수를 측정하기 위하여 비장세포는 EZ-CyTox (Dogen, Korea)를 사용하였고, 3T3 와 CT26 세포주는 MTT Powder (Amresco, Korea)를 사용 하였다. 이 외에 본 연구에 사용한 일반적인 시약은 Sigma aldrich에서 구입하여 사용하였다.
3.세포독성
야채수프의 항암효과를 알아보기 위하여 3T3 및 CT26 세 포의 증식에 미치는 세포독성을 측정하였다. 야채수프를 처 리한 후 부착세포인 3T3 및 CT26의 세포생존율을 MTT assay를 사용하여 측정하였다. 먼저 96 well plate에 well당 1×104의 세포를 분주한 후 48시간 동안 37°C, 5% CO2 배 양기에서 배양한 후 야채수프를 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 μL/mL의 농도로 각 well에 첨가하고 48시간 동안 배 양하였다. 각 well에 MTT solution (5 mg/mL)을 10 μL씩 첨가한 후 37°C에서 4시간 동안 반응하여 crystal 생성을 유 도하였다. 배지를 흡입 제거한 후에, DMSO solution (D2650, Sigma aldrich)을 100 μL/well 농도로 첨가하여 15분간 암실 조건에서 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험에 사용한 배양배지 100 μL와 MTT solution (5 mg/mL) 10 μL를 섞어 blank로 활 용하였고, 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
MTT assay로 측정된 값을 대조군에 대한 백분율로 환산 하여 각 농도에 따른 세포 생존율(viability (%))을 계산한 다 음 추세선을 활용하여 세포생존율 50%를 만드는 IC50 (inhibitory concentration 50)을 측정하였다.
4.세포자살(Apoptosis) 분석
3T3와 CT26 세포를 48 well plate에 2×104 cells/well로 24시간 배양 후 야채수프를 각각 100, 50, 25 μL/mL 농도로 처리하고 24시간 후에 회수하였다. Annexin V apoptosis detection kit (88-8005-72, eBioscience, San Diego, USA) 를 이용하여 각 세포를 염색한 후 유세포분석기(FACS Versa, BD, USA)로 분석하였다. 각 처리군에서 2×104개의 세포 중 Annexin V와 PI (propidium iodide)가 함께 염색된 세포수 를 측정하여 백분율(%)로 late apoptosis의 발생비율을 계산 하였다.
5.마우스 비장에서의 비장세포의 추출과 proliferation assay
6주령의 암컷 Balb/c mouse (Orient Bio Inc., Korea)에서 비장을 적출한 후, RBC lysis buffer를 사용하여 적혈구를 제거한 순수면역세포를 얻은 다음, cell strainer를 사용하여 현탁하여 단일 세포 형태의 비장세포를 분리하였다. 비장세 포의 증식능을 측정하기 위하여 U bottom의 96 well plate 에 비장세포를 1×104 cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 야채수프를 각각 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 μL/mL 농도로 well에 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 여기에 EZ-CyTox (Dogen, Korea) 를 각 well에 10 μL씩 첨가하여 3시간 동안 배양기에서 반 응시키고 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 실험에 사용한 배양배지 100 μL와 EZCyTox 10 μL를 섞어 blank로 활용하였고, 세포 생존율은 대 조군에 대한 백분율로 나타내었다.
6.세포 공배양
CT26 암세포와 비장세포의 공배양은 Kano(2015)의 방법을 변형하여 사용하였다. 공배양을 위한 배지는 1% penicillin이 포함된 RPMI1640 (Welgene, Korea) 배지에 10% FBS을 첨가하여 사용하였다. CT26 암세포를 48 well plate에 5×104 cells/well로 분주하여 1시간 후 암세포가 바닥에 부착 된 것을 확인한 다음, 6주령의 암컷 Balb/c mouse (Orient Bio Inc., Korea)에서 분리한 비장세포를 5×105 cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 공배양하였다.
야채수프는 처리군별로 각각 100 μL/mL와 50 μL/mL 농 도로 각 well에 처리하였고, 양성 대조군은 5 μg/mL 농도의 concanavalin A (Con A)를 처리하였다. 시료를 처리한 후 48시간 동안 배양한 다음 CT26 암세포와 비장세포의 세포 수를 측정하였다.
7.사이토카인 측정
CT26 암세포와 비장세포에 야채수프를 처리하여 48시간 동안 공배양한 후, 배양액을 회수한 다음 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. ELISA kit (BD Biosciences, USA)를 이용하여 각 처리군별로 야채수프에 의 해 생성된 사이토카인(IL-12, IFN-γ)의 함량을 측정하였다.
8.통계처리
본 실험에서 얻어진 결과는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS, ver. 24, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였고, 시료군 간의 유의성은 유의 수준 p<0.05에서 Duncan’s multiple range test로 비교하였다.
III.결과 및 고찰
1.야채수프의 일반세포 및 암세포에 대한 세포독성
야채수프의 세포독성을 평가하기 위해 일반세포인 3T3와 마우스 암세포인 CT26 세포주를 대상으로 MTT assay를 수 행하였다. 기존의 야채수프와 4개의 개량된 야채수프를 포함 한 5종류의 야채수프의 세포독성을 평가하였으며 100 μL/mL 농도로 처리했을 때, 전체적으로 일반세포인 3T3 세포는 평 균 약 71.2%의 생존율을 보인 반면, CT26 암세포는 평균 약 51.6%의 생존율만 보여 암세포에 상대적으로 높은 세포 독성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 기존의 야채수프의 세 포독성에 대한 연구 결과와 유사한데, 열수추출한 야채수프 를 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 대하여 세포독성 을 평가한 결과 세포독성이 거의 없었다(Sim et al. 2010). 또한, 야채수프의 원료를 각각 추출하여 암세포에 대하여 세 포독성을 평가한 결과 표고버섯과 당근은 위암 세포주인 AGS 세포에 대하여 암세포 증식 억제효과를 보였고, 무청, 우엉, 당근은 혈액암 세포주인 HL-60에 대해서 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, 폐암 세포주인 A549에는 무와 무 청이 현저한 효과를 나타내었으나(Park & Park 2016), 마우 스 대장암 세포주인 CT26 세포에 대한 결과는 보고된 바 없 었다.
일반세포인 3T3 세포에 야채수프를 처리했을 때는 처리군 에 관계없이 유사한 경향을 나타내었으나, 암세포인 CT26 세포에 야채수프를 처리했을 때에는 처리군에 따라 다른 경 향을 나타내었다. 특히 개량된 제품인 야채수프4 처리군과 야채수프5 처리군에서는 암세포의 세포 생존율이 각각 50.0, 40.6%로 기존의 야채수프1 처리군에 비해 암세포 증식 억제 능이 우수하였다<Figure 1>. 또한 야채수프를 암세포에 25 μL/mL 농도로 처리했을 때 처리군별로 큰 차이를 나타내 는 것을 알 수 있었다. 야채수프1 처리군에서는 84.9%의 암 세포 생존율을 보였지만, 야채수프2 처리군과 야채수프3 처 리군에서는 암세포의 생존율이 각각 92.5, 100%로 오히려 증가하여 암세포 억제능이 거의 없는 것으로 나타났다. 그러 나, 야채수프4 처리군과 야채수프5 처리군에서는 암세포의 생존율이 각각 71.0, 61.7%로 낮아져 개량된 야채수프4, 5가 기존의 야채수프에 비해 암세포 억제 효과가 크게 증진된 것 을 알 수 있었다.
또한, 특정 물질이 암세포의 증식을 50% 억제하는 농도를 측정하는 IC50 결과에서도 야채수프1 처리군에 비해 야채수 프2와 야채수프3 처리군에서 더 높은 값을 나타내어 암세포 억제 효과가 감소한 것으로 나타났다. 그러나 야채수프4 처 리군과 야채수프5 처리군에서는 IC50이 각각 63.36, 51.75 μL/mL로 나타나 암세포 억제 효과가 증가한 것을 알 수 있 었다<Figure 1>.
2.야채수프가 암세포의 세포자살(Apoptosis)에 미치는 영향
야채수프의 암세포에 대한 증식억제 효과가 세포자살에 의 한 것인지를 확인하기 위하여 유세포분석기(Flow cytometry) 를 이용하여 세포자살 정도를 측정하였다. 일반적으로 세포 는 세포자살과정에서 세포 내부에 존재하던 phosphatidyl serine (PS)이 외부로 노출되는데, 이는 형광시약인 Annexin V와 결합시킨 후 형광측정을 통하여 파악할 수 있다(Vermes et al. 1995). 또한, 형광시약 PI는 세포막을 통과하여 핵을 염색하게 되는데 세포자살이 일어나는 세포는 Annexin V와 PI에 함께 염색되므로 이를 형광측정이 가능한 유세포분석기 를 이용하여 세포의 late apoptosis 정도를 확인하였다(Rieger et al. 2011).
일반세포인 3T3와 암세포인 CT26에 5종의 야채수프를 처 리한 후 48시간 뒤 각각의 세포를 회수하여 확인한 결과 일 반세포 3T3에서의 발생 정도는 모두 2% 미만이었으나, 암 세포인 CT26에서는 3~5배 높은 비율로 세포자살이 나타나 는 것을 알 수 있었다. 이는 야채수프가 일반세포에는 큰 영 향을 미치지 않지만 암세포에는 세포자살을 유도한다는 것 으로 세포독성 실험에서 일반세포에는 세포독성이 크지 않 으나, 암세포에는 강한 증식억제 효과를 나타낸다는 결과와 도 일치한다. 또한, CT26 암세포에서는 모든 처리군에서 야 채수프의 농도가 높아질수록 세포자살 정도가 높아지는 것 으로 나타나 야채수프가 농도의존적으로 암세포의 세포자살 을 일으킨다는 것을 알 수 있었다.
야채수프가 세포자살에 미치는 연구로는 재료 중 하나인 당근의 유지추출물을 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포 에 처리했을 때 PARP의 절단과 더불어 Bax 단백질이 증가 되고 Bcl-2 수준이 낮아져, 세포주기가 중지되고 세포자살을 증가시킨다고 보고되어 있다(Shebaby et al. 2014). 우엉추출 물을 유방암 세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에 처 리했을 때에도 농도와 시간의존적으로 세포자살이 나타났으 며(Ghafari et al. 2017), 당근의 헥산추출물을 자궁암 세포주 인 HeLa, 폐암 세포주인 A549, 유방암 세포주인 MCF-7, 전립선 암세포인 PC-3에 처리했을 때 p53의 상태와 관계없 이 암세포의 세포자살이 유발되었다(Beevi et al. 2010). 야 채수프의 각 재료가 세포자살을 일으키는 것으로 볼 때 야 채수프의 세포자살 유발 효과는 각 재료에 포함된 성분이 복 합적으로 작용하여 일어난 것으로 판단된다.
각 처리군별 비교에서는 25, 50 μL/mL 농도에서는 야채수 프 처리군간 큰 차이를 나타내지 않았으나, 100 μL/mL 농도 로 야채수프를 처리한 경우 야채수프5 처리군에서 기존의 야 채수프인 야채수프1 처리군보다 높은 17.3%의 세포자살률을 나타내었다<Figure 2>. 이러한 결과 역시 세포독성 실험에서 야채수프5 처리군이 강한 암세포 억제 효과를 보인 결과와 일치하는 것으로, 이는 야채수프5에 추가된 둥굴레와 감귤 추출물, 레몬 추출물에 포함된 물질들의 시너지 효과로 인한 것으로 판단된다.
3.야채수프의 비장세포 증가 효과
마우스의 비장에서 면역세포인 비장세포를 분리하여 야채 수프를 처리한 후 48시간 동안 배양하여 비장세포의 수가 증 가되는 효과를 확인하였다<Figure 3>. 야채수프 100 μL/mL 을 처리하여 유의 수준 p<0.05에서 비교한 결과, 대부분의 처리군에서 양성대조군인 Con A (5 μg/mL)와 유사하거나 높은 비장세포 증가율을 나타내었으며, 25 μL/mL을 처리하 여도 PBS를 처리한 음성대조군보다 유의적으로 높은 비장 세포 증가율을 나타내었다. 이러한 결과는 야채수프를 25 μL/mL 농도만 처리하여도 비장세포가 증가함으로써 야채수 프가 비장에 존재하는 면역세포의 수를 증가시키고, 면역력 을 강화한다는 것을 의미한다. 특히 Con A는 시험관 내에서 비장세포 중의 T 세포를 활성화시키는데 사용되는 분열촉진 인자로서(Palacios 1982), 야채수프가 Con A와 유사하거나 높은 비장세포 증가율을 보여준 것을 볼 때 야채수프가 비 장세포에 존재하는 T 세포를 활성화시킨 것으로 판단된다. 또한, 100 μL/mL을 처리한 경우 PBS 처리군에 비해 최소 266% (야채수프4)에서 최대 541% (야채수프5)의 비장세포 증가율을 나타내어, 야채수프가 비장세포 증식을 통한 면역 력 강화에 매우 효과적임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 야 채수프가 암세포에 대하여 직접적으로 세포 억제 효과를 나 타낼 뿐 아니라 면역세포를 증식시킴으로써 면역세포를 통 한 암세포 증식억제에 대한 가능성을 보여준다.
특히, 야채수프5 처리군에서는 100 μL/mL 농도로 처리했 을 때의 비장세포 증가율이 541%로서, 기존의 야채수프인 야 채수프1 처리군의 증가율인 435% 보다 매우 높게 나타났는 데, 이것은 야채수프의 암세포에 대한 세포독성 실험 및 세포 자살 측정 결과, 야채수프5 처리군이 기존의 야채수프보다 암 세포 억제율이 높고 세포자살율이 높다는 결과와도 일치한다.
야채수프 재료의 면역세포 활성화에 대한 연구로는 우엉 추출물과 다른 식물 추출물을 마우스 비장세포에 처리한 후 4일과 7일 후에 세포수를 측정한 결과, 우엉 추출물 처리군 에서 비장세포수, 항체생성세포수 및 IgM의 농도가 가장 높 게 나타나 비장세포를 효과적으로 활성화하였으나, 대식세포 수와 대식세포활성은 상대적으로 낮게 증가되었다고 보고되 었다(Borsuk et al. 2011). Kim et al.(2014)은 표고버섯에서 분리한 다당체가 RAW264.7 대식세포의 활성을 증가시킬 뿐 아니라 마우스 비장세포의 증식을 46.3% 증가시키고, 혈중 INF-γ 농도도 32% 증가시켰으며, 사이토카인의 농도를 측정 한 결과, IL-2, IL-6, IL-12는 증가한 반면, IL-4, IL-5, IL- 10은 감소하여 표고버섯 다당체는 Th1 면역반응을 촉진한다 고 보고하였다. 또한, 곰팡이 독소인 zearalenone이 처리된 마우스에 무 추출물을 투여할 경우 혈중 림프구, 면역글로불 린, 자연살해세포, T 세포, B 세포 등 면역세포가 증가되어 무 추출물에 의한 면역세포 활성화가 확인되었다(Ben et al. 2008). 이러한 야채수프 재료 각각의 면역세포 활성화 기능 은 각 재료의 복합추출물인 야채수프에서 각 성분의 상호작 용으로 인해 비장세포의 증가로 나타난 것으로 판단된다.
4.암세포와 비장세포와의 공배양에서 야채수프의 면역력 증 강 효과
암세포인 CT26과 마우스 비장세포를 공배양한 후 야채수 프를 처리하여 48시간 동안 배양한 다음 암세포와 마우스 비 장세포의 세포수 및 분비된 사이토카인의 함량을 측정하여 면역력 증강 효과를 확인하였다.
암세포 CT26과 마우스 비장에서 분리한 비장세포의 공배 양액에 5종의 야채수프를 50 μL/mL와 100 μL/mL 농도로 각각 처리하고 48시간 후에 각 처리군을 현미경으로 관찰한 결과, 야채수프 무처리군에 비해 야채수프 처리군에서 CT26 암세포의 세포 밀도가 현저히 줄어든 것을 확인 할 수 있었 다<Figure 4>. 현미경을 통해 야채수프 처리에 따른 암세포 의 형태학적 변화가 관찰되었고, 야채수프의 처리군간 암세 포의 밀도 차이도 비교적 명확하게 관찰되었다. 특히, 야채 수프를 50 μL/mL의 농도로 처리했을 때 야채수프4와 야채 수프5 처리군에서 상대적으로 크게 암세포의 세포 밀도가 줄 어든 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 현상은 100 μL/mL 농도로 처리한 군에서도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다.
암세포와 비장세포의 공배양시 야채수프의 효과를 정량적 으로 확인하기 위하여 48시간 동안 공배양한 후에 암세포 CT26의 세포수를 확인한 결과, 암세포에 비장세포만 처리했 을 때보다 비장세포와 야채수프를 같이 처리했을 때 야채수 프3 처리군을 제외한 모든 처리군에서 암세포가 유의적으로 감소하였다<Figure 4>. 암세포에 비장세포만 처리한 경우 약 26.5%의 암세포 감소율을 보인 반면, 야채수프를 50 μL/mL 농도로 비장세포와 같이 처리한 경우에는 야채수프1 처리군 에서 37.7%의 암세포 감소율을 보이고 야채수프4, 야채수프 5 처리군에서는 모두 60.3%의 암세포 감소율을 나타내었다. 또한, 야채수프를 100 μL/mL 농도로 처리한 경우에도 50 μL/mL 농도로 처리한 결과와 유사한 암세포 감소율을 나타 내어, 비장세포와의 공배양시 50 μL/mL 농도의 야채수프로 도 충분한 암세포 감소효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다. 한편, 야채수프4, 야채수프5 처리군에서 보인 암세포 감소율 은 비장세포 단독 처리군의 2배에 해당하며, 기존 야채수프 인 야채수프1 처리군보다도 높은 감소율로서 야채수프4, 야 채수프5가 비장세포와의 공배양시에 암세포를 효과적으로 억 제한다는 것을 알 수 있었다.
암세포와 비장세포와의 공배양시 야채수프에 의한 암세포 감소가 비장세포에 의한 것인지 확인하기 위하여 야채수프 처리 48시간 후 비장세포 수의 변화를 측정하였다. 야채수프 무처리군에서는 비장세포가 150.4%의 증가를 나타낸 반면, 야채수프를 처리한 경우 모든 처리군에서 280.2% 이상의 높 은 증가율을 나타내었다<Figure 4>. 또한, 야채수프의 농도 를 50 μL/mL 처리했을 때와 100 μL/mL 처리했을 때 비장 세포의 증가율은 야채수프5를 제외한 모든 처리군에서 큰 차 이 없이 유사하게 나타났다. 암세포와 비장세포를 공배양할 때 야채수프에 의해 비장세포의 수가 증가되는 결과는 비장 세포를 단독으로 배양하며 야채수프를 처리했을 때 야채수 프에 의해 비장세포의 수가 증가된 결과와 유사하다. 또한, 암세포와 비장세포의 공배양시 야채수프의 처리에 의해 암 세포가 감소된 결과도 야채수프에 의해 직접적으로 암세포 의 증식이 억제된 효과 외에 면역세포인 비장세포의 증가에 의한 영향인 것으로도 사료된다.
야채수프에 의한 암세포의 감소가 면역세포의 활성화에 의 한 것인지를 확인하기 위하여 암세포와 비장세포의 공배양 시 야채수프에 의해 생성되는 사이토카인의 함량을 측정하 였다. 일반적으로 사이토카인은 면역세포가 활성화 되었을 때 만들어지는 물질로 이것은 다른 면역세포를 활성화하거 나 분화시켜 면역반응에서 중추적 역할을 한다고 알려져 있 다(Showalter et al. 2017). 특히 IFN-γ와 IL-12는 T helper 세포(CD4+ T cell)에서 만들어져 Th1 면역반응을 유도하고 세포 독성 T 세포(cytotoxic CD8+ T cell)를 활성화하여 결 과적으로 암 종양세포를 파괴한다(Minciullo et al. 2015). 야 채수프를 각 처리군별로 50 μL/mL 농도와 100 μL/mL 농 도로 처리하여 암세포와 비장세포를 48시간 동안 공배양한 후 배양액 내에 생성된 IFN-γ와 IL-12의 함량을 ELISA로 측정한 결과, 야채수프1, 야채수프4 및 야채수프5 처리군에 서 유의적으로 높은 함량을 나타내었다. IFN-γ의 측정 결과, 야채수프1, 야채수프4 및 야채수프5 처리군에서 Con A (5 μg/mL) 처리군보다는 낮지만 무처리군 보다는 매우 높은 약 200 pg/mL의 IFN-γ을 생성하였고, 특히 야채수프5를 100 μL/mL 농도로 처리했을 때 가장 많은 354 pg/mL의 IFN-γ 를 생성하였다. 또한, IL-12의 함량을 측정한 결과도 야채수 프를 처리하지 않고 암세포와 비장세포를 공배양한 경우에 는 26 pg/mL만 생성했지만, 야채수프를 처리하여 공배양한 경우에는 야채수프1, 야채수프4 및 야채수프5 처리군에서 6.6~8.3배 많은 량을 생성하여 IFN-γ와 유사한 결과를 보여 주었다.
암세포와 면역세포의 공배양은 면역세포에 대한 암세포의 반응을 관찰하고, 면역세포가 분비하는 사이토카인의 증감을 분석하여 면역력 증강효과를 분석하기 위하여 사용된다. Song(2016)은 면역세포인 자연살해세포와 암세포를 공배양 하였을 때 Interlukin-12 (IL-12)와 Interlukin-15 (IL-15)에 의해 자연살해세포가 활성화되지 않으면 암세포 억제효과를 거의 나타내지 못하였으며, 활성화된 자연살해세포도 세포주 에 따라 다른 세포독성을 보여 A549이나 Huh7 암세포에는 거의 효과가 없는 반면 HeLa 암세포에는 강한 억제 효과를 보여주었다고 보고하였다. 마우스 흑색종인 B16-F10 암세포 와 마우스 비장세포를 공배양한 연구에서는 Snail- 암세포에 비해 Snail+ 암세포에서 비장세포와 CD4+, CD8+ T 세포가 모두 감소하였는데, 이는 Snail+ 암세포가 사이토카인인 TGF-β와 thrombospodin-1(TSP1)의 분비를 증가시킴으로써 면역억제 기작을 유도하였기 때문이다(Kudo-Saito et al. 2009). 또한, 마우스 암세포인 4T1과 비장세포의 공배양에서 는 암세포에 의해 비장세포가 분비하는 IFN-γ가 감소하였으 나 TNF-α는 큰 변화가 없었던 반면, CT26 암세포에 의해서 는 비장세포의 IFN-γ 분비 감소가 발생하지 않아 면역억제 기작이 발생하지 않았다(Kano 2015). 이러한 결과는 CT26 암세포에 대해서는 IFN-γ에 의한 비장세포의 암세포 억제기 작이 정상적으로 작동한다는 것으로서, CT26 암세포와 비장 세포의 공배양에서 비장세포가 분비하는 IFN-γ의 증감이 면 역활성을 측정하는 중요한 지표라는 것을 의미하며, 본 연구 에서는 야채수프에 의해 비장세포의 IFN-γ 분비가 증가된 결 과를 나타내었다.
또한, IL-12는 암이나 항원에 의해 면역반응이 일어나면 STAT4를 통해 T 세포 혹은 자연살해세포로 하여금 IFN-γ를 생성되게 하는 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있어(Zundler & Neurath 2015), IFN-γ와 IL-12의 증가는 T 세포를 중심 으로 한 면역세포의 활성화를 의미한다(Yang et al. 2016). 본 연구에서도 야채수프에 의해 IL-12가 생성되고, 이로 인 해 IFN-γ가 증가된 것으로 판단되며, 이러한 결과로 볼 때 암세포와 비장세포의 공배양시 야채수프4, 야채수프5 처리군 에서의 높은 암세포 감소율과 비장세포 증가율은 면역세포 의 활성화에 의한 항암효과인 것으로 사료된다.
5.야채수프의 조성 및 공정이 항암 및 면역력 증강에 미치는 효과
5종류의 야채수프를 이용하여 CT26 암세포에 대한 항암효 과와 면역력 증강효과를 평가한 결과 모든 야채수프가 암세 포 증식 억제 및 면역력 증강 효과를 나타내었지만, 야채수 프 처리군별로 다른 효과를 나타내었다.
항암효과에 있어서 암세포 증식 억제는 야채수프4와 야채 수프5가 유의적으로 낮은 IC50을 나타내어 더 큰 암세포 억 제 효과가 있다는 것을 보여주었고, 야채수프에 의한 암세포 의 세포자살 비율을 측정한 결과도 야채수프5가 높은 세포 자살률을 나타내었다. 이러한 결과는 기존의 야채수프인 야 채수프1에 비해서 개량한 야채수프4와 야채수프5가 훨씬 더 효과적으로 암세포를 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 특 히, 개량한 야채수프인 야채수프2~5가 모두 무청의 압출성 형이나 우엉의 덖음 등 동일한 공정변화를 적용하였음에도 불구하고, 야채수프2와 야채수프3은 야채수프1에 비해 암세 포 억제효과가 큰 차이가 없었던 반면, 야채수프4와 야채수 프5는 암세포 억제효과가 현저히 증가하였던 것은 제조공정 에 의한 추출 성분의 변화보다 재료의 조성이 더 큰 영향을 미치는 것으로 판단된다. 실제로 야채수프4와 야채수프5에는 재료에 둥굴레가 공통으로 포함되어 있어 야채수프4와 야채 수프5의 상대적으로 높은 암세포 억제효과는 여러 식물 재 료 중 둥굴레에 포함된 사포닌과 lectin 등에 의한 영향인 것 으로 사료된다(Khan et al. 2012). 둥굴레에서 분리된 사포닌 은 HeLa 세포에 대하여 세포독성을 나타내며(Yang & Yang 2006), lectin은 미토콘드리아의 활성산소 축적을 유도하여 p38과 p53을 활성화시킴으로써 사람 흑색종인 A375 암세포 의 세포사멸과 자가포식을 유도한다(Liu et al. 2009). 또한, 전반적으로 야채수프5에서 가장 높은 암세포 억제효과가 나 타났는데, 이는 둥굴레 외에 야채수프5에 추가적으로 첨가된 레몬 추출물, 감귤 추출물에 포함된 성분간의 시너지 작용으 로 인해 암세포 억제효과가 가장 높게 나타난 것으로 판단 된다(Craig 1997).
면역세포의 활성화를 통한 항암효과를 분석하기 위해 야 채수프에 의한 비장세포의 증가율을 측정한 결과에서도 야 채수프5를 처리한 군에서 다른 처리군보다 높은 비장세포 증 가율을 나타내어 직접적인 암세포 억제효과를 측정한 것과 유사한 결과를 보여주었다. 암세포와 비장세포를 공배양하면 서 야채수프에 의한 암세포의 감소율을 측정한 결과와 비장 세포의 증가율을 측정한 결과 역시 야채수프4와 야채수프5 가 높은 암세포 감소율을 보여주었고, 야채수프5를 처리한 군에서 높은 비장세포 증가율을 나타내었다. 이러한 결과는 비장세포가 생성한 사이토카인을 측정한 결과에서도 유사하 게 나타나 야채수프1, 야채수프4 및 야채수프5를 처리한 군 에서 IFN-γ와 IL-12의 생성이 높게 나타나는 것을 알 수 있 었다. 즉, 야채수프에 의한 면역세포의 활성화는 야채수프1, 야채수프4 및 야채수프5를 처리한 군에서 강하게 일어나며, 이를 통해 야채수프4와 야채수프5가 암세포를 더 효과적으 로 억제하는 것으로 판단된다.
암세포와 비장세포의 공배양을 통한 야채수프의 암세포 억 제효과를 측정한 결과, 암세포에 직접 야채수프를 처리한 결 과와 유사하게 야채수프4와 야채수프5에서 높은 암세포 억 제효과를 보여 주었으며, 이는 야채수프4와 야채수프5에 공 통적으로 추가된 둥굴레 성분에 의한 것으로 판단된다. 둥굴 레에 의한 면역증강효과는 주로 둥굴레의 다당류 성분에 의 해 일어나는데, RAW264.7 대식세포의 식작용을 촉진시키고 비장세포 중 T 세포와 B 세포의 증식과 IL-2, TNF-α, IL- 8, IL-10 등의 사이토카인을 조절하여 면역활성을 증진시킨 다(Liu et al. 2017). 특히, 야채수프3에는 레몬 추출물, 감귤 추출물 등이 포함되어 있음에도 불구하고 면역세포 활성화 를 통한 암세포 억제효과가 크게 나타나지 않은 것으로 보 아 레몬 추출물, 감귤 추출물 등에 포함된 성분은 직접적인 면역세포 활성화를 나타내기 보다 다른 성분에 의한 암세포 억제효과를 도와주는 상승효과를 나타내는 것으로 사료된다. 또한, 기존의 야채수프인 야채수프1과 다르게 야채수프2~5 에서 모두 압출성형 공정과 덖음 공정을 적용했음에도 불구 하고 야채수프2와 야채수프3에서 면역세포 활성화를 통한 암 세포 증식억제 효과를 크게 나타내지 못한 것으로 보아 추 출성분을 증진시키는 압출성형이나 덖음 공정 등의 공정 변 화에 의한 면역세포 활성화 및 암세포 억제효과는 미미한 것 으로 사료된다.
결과적으로 본 연구에서는 기존의 야채수프를 포함한 5종 류의 야채수프가 모두 항암효과와 면역활성을 증진시키는 것 을 확인하였으며, 그 중 둥굴레가 포함된 야채수프4와 야채 수프5가 가장 큰 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 따 라서, 둥굴레에 의한 항암효과와 면역활성을 추가적으로 연 구할 필요가 있으며, 특히 야채수프는 복합식물추출물이므로 항암 및 면역활성에 대하여 각 성분이 복합적으로 작용하여 시너지 효과를 일으키는 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
IV.결론 및 요약
본 연구는 기존의 야채수프보다 생리활성기능이 우수한 야 채수프를 개발하기 위하여 재료의 조성과 가공 공정이 변화 된 4가지 야채수프를 추가로 제조한 후, 각 야채수프의 항암 효과 및 면역증강 효과를 살펴보았다. MTT assay를 통한 세 포독성 시험 결과, 모든 야채수프가 정상세포인 3T3보다 마 우스 대장암 세포인 CT26에 높은 증식 억제효과를 나타내 었으며, 특히 둥굴레가 포함된 야채수프가 우수한 암세포 증 식 억제효과를 나타낸다는 것을 IC50 측정을 통해 확인하였 다. 또한, Annexin V와 PI 염색을 통해 야채수프에 의한 세 포자살 발생비율을 측정한 결과 암세포에서 정상세포보다 3~5배 높은 비율로 세포자살이 일어나는 것을 확인하였다. 마우스 비장세포에 야채수프를 첨가하여 배양할 경우 모든 야채수프 처리군에서 세포수가 최소 266%에서 최대 541% 까지 증가되었고, 둥굴레와 레몬 추출물, 감귤 추출물이 포 함된 야채수프 처리군에서 가장 큰 증가율을 나타내었다. CT26 암세포와 마우스 비장세포를 공배양하며 5종의 야채 수프를 처리하고 48시간 후 세포 수를 관찰한 결과, 비장세 포의 수는 모든 야채수프 처리군에서 280% 이상 증가하였 고, CT26 암세포의 수는 둥굴레가 첨가된 야채수프 처리군 에서 60% 가량 현저히 줄어들었다. 또한, IFN-γ와 IL-12의 생성 역시 둥굴레가 포함된 야채수프 처리군에서 높게 나타 나 암세포 억제효과가 야채수프의 직접적인 사멸 효과 외에 면역세포의 활성화를 통해서도 나타나는 것을 알 수 있었다. 그러나, 압출성형이나 덖음 공정에 의한 암세포 억제효과 및 면역증강 효과는 크지 않은 것으로 판단된다. 결론적으로, 모 든 야채수프가 CT26 암세포에 대한 암세포 억제효과를 나 타내었으며, 그 중에서도 둥굴레가 포함된 야채수프가 면역 세포 활성화와 암세포 억제효과를 가장 크게 나타내었고, 이 러한 결과는 공정과 조성 변화를 통한 야채수프의 기능성 연 구에 중요한 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.
