I.서 론
생활 수준의 향상 및 외식 문화의 증가로 인해 식습관이 서구화되면서, 심혈관계 질환과 각종 만성질환의 유병율이 증가하면서 암, 당뇨, 성인병 등을 예방하는 방법에 대한 관 심이 증가하고 있다. 많은 건강 기능성 식품이 개발되어 시 판되고 있고, 특히 면역 기능의 향상을 통한 질병의 예방에 촛점을 맞춘 중재법이 각광을 받고 있다. Probiotics를 이용 한 식물성 유래 식품의 활용이 증대되면서 음료 시장의 추 세도 단순한 기호식품의 보급에서 건강 음료의 확산으로 바 뀌고 있다(Kim 2010).
식물성 원료로 만든 발효유는 일반적으로 원료에 당을 첨 가하거나 유산균, 효모 등의 미생물을 첨가하여 발효시킴으 로 제조되게 되는데, 이때 식물체에는 여러 가지의 효소가 함유되어 있어, 식물 추출액을 발효시키면 많은 효소들이 활 성화됨과 더불어 식물 자체에 들어있는 각종 기능성 성분을 다양하게 생성되게 된다(Kim & Kwon 2009). 또한 식물 자 체에 함유되어 있는 여러 가지 성분들이 발효 과정 동안 생 화학 반응을 일으킴으로써 새로운 생리 기능성이 만들어지 게 되고, 식물체의 영양 성분이 소화, 흡수되기 쉬운 형태로 변환될 수 있다(Lee et al. 2007).
젖산균을 이용한 probiotic 음료에는 오미자(Cho et el. 2010), 감자(Kim & Yoon 2013), 자색고구마(Jung & J u1997)등을 활용하여 개발된 식품들이 상품화 되고 있다. Probiotics란 ‘숙주의 장내 균총 능력을 개선시킴으로써 숙주의 건강에 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물’이라 정 의하고 있다(Havenaar & Huisveld 1992). Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus와 같은 젖산균이 probiotic에 많이 이용되고 있으며, 이 균들은 식품 내에서 젖산 발효를 일으켜 식품의 부패를 방지하고 bacteriocin과 같은 항균물질 을 분비하여 식중독 균의 성장을 억제하며, 장내 pH를 낮추 어 장내 부패 세균의 증식을 억제하는 등의 효과를 가지고 있다(Ahn et al. 2003; Park & Yang, 2003).
귤나무(Citrus unshiu Markovich)의 덜 익은 열매 껍질을 청피(靑皮)라고 하며, 완전히 익은 열매 껍질을 진피(陳皮) 또는 귤피(橘皮)라고 한다. 귤은 10~11월에 열매가 익으며 제주도 및 남해, 다도해 섬 지방에서 재배하는 귀화식물로 열매 껍질에 정유의 주성분인 d-limonene, flavonoid인 hesperidin, naringin, neohesperidin, alkaloid인 synephrine등 이 함유되어 있다(Kim et al. 1999). Hesperidin이나 naringin과 같은 flavonoid 물질은 암세포의 증식을 억제하며 모세 혈관의 수축, 이완을 촉진시켜 고혈압을 예방하고, 혈 액 내 LDL 콜레스테롤의 양을 저하시켜 혈관의 건강을 증 진시킨다고 보고 되고 있다(Kim & Kim 2003; Yoon & Jwa 2006). 감귤 진피의 항산화 기능에 대한 보고(Jae et al. 2010)는 있으나, 감귤 진피를 이용한 가공품에 관한 연구는 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 건강에 유익한 생리 활성을 가진 귤 진피의 부가가치를 높이고 이용도를 넓히고 자, 각종 probiotics를 이용해 감귤진피 발효액을 제조하고자 하였으며, 발효를 시킨 뒤에도 항균력이 남아있는 지 확인하 기 위해 식중독 유발 세균 중 저항성이 강한 Campylobacter jejuni에 대한 항균성을 조사하였다.
II.연구 내용 및 방법
1.재료 및 시료 추출
본 연구에 사용한 감귤 진피는 제주도산을 구입하여 사용 하였다. 수세한 후 건조되어진 귤 진피와 증류수의 비율을 1:10으로 하여 60°C, 625 kHz 초음파 병합 추출기(Sonimedi, Seoul, Korea)에서 6시간 증류하여 추출한 후, bottle top filter 0.22 μm (Millipore, Beijing, China)로 무균 처리 하여 실험 종료 시까지 5°C 냉장보관 하였다.
2.Probiotics 및 감귤 진피 발효액 제조
감귤 진피 발효에 사용한 균주는 농촌진흥청 산하 국립 농 업 유전자원정보센터에서 분양 받아 사용하였다<Table 1>. 균의 생육 및 보존을 위해서 MRS broth (Difco, Burlington, NC, USA)배지에 접종하고, 37°C Incubator (HK-IB072, 한 국종합기기제작소)에서 12~24시간 배양하여 대수기 균을 만 들어 사용하였다(Kim & Kwon 2009). 감귤 진피 추출액에 균주를 1% 접종하고, glucose, peptone, yeast extract, K2HPO4 (Sigma, St. Louis. MO. USA)를 각각 농도별로 첨가한 후 37°C에서 배양하며 510 nm, spectrophotometer (Kontron instruments, UVIKON-930, Augsburg Germany) 로 성장을 관찰하였다(Ahn et al. 2003).
3.pH 및 적정 산도 측정
pH의 측정은 pH meter (Horiba F-51, Kyoto, Japan)를 이용하여 시간대별로 모니터링 하였으며, 산도는 발효액 10mL에 0.1% phenolphthalein 용액(Ducksan, Chemical Ind., Kwanju-kun, Korea) 2~3방울을 가하고, 0.05 N NaOH용액 (Ducksan, Chemical Ind., Kwanju-kun, Korea)으로 적정하 였으며, 소비된 0.05 N NaOH로부터 젖산의 함량(%)을 계산 하였다. 산도 및 pH측정은 3회 반복하였다.
4.생균수 측정 및 항균 실험
감귤 진피 발효액의 생균수는 계대 희석법을 이용하여 측 정하였으며, 항균력 측정은 paper disc (8mm size, Advantec, Toyo Roshi, Ltd., Tokyo, Japan)법을 변형하여 사용하였다 (Davidson & Parish 1989). 멸균된 Brucella broth배지에 O.D값 0.2까지 배양한 Campylobacter jejuni 1%를 접종하 여 균일하게 섞어준 후, 멸균된 paper disc를 밀착시켜 감귤 진피 발효액을 농도별로 20 μL씩 천천히 흡수시켰다. 37°C, COincubator에서 24시간 배양한 후, disc 주변에 생성된 clear zone (mm)의 크기를 측정하였다.
5.통계 처리
모든 실험은 2회 이상 반복 측정하였으며, 통계 처리는 SPSS software (ver. 21 IBM SPSS Statistics)를 이용하여 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 샘플 간의 유의적 차이를 검증하였다.
III.결과 및 고찰
1.발효액 제조용 균주 선택
감귤 진피 추출물에 접종한 7종의 균주 중 활발한 성장을 보인 균주는 B. longum, B. bifidum, L. mesenteroides 순이 었다<Figure 1>. B. longum과 B. bifidum은 모유를 섭취하 는 신생아의 장관 내에서 발견되는 균으로, 성인들의 경우 이 균이 함유된 발효 음료나 요구르트를 섭취하면 성숙한 장 관 내 균총을 유익한 것으로 전환시켜, 정장 작용이나 면역 기능등을 항진 시키는 것으로 알려져 있다(Chen 1999). L. mesenteroides는 한국인들이 많이 섭취하는 김치의 발효 후 기에 주로 발견되는 젖산균으로 bacteriocin 같은 항균성 물 질을 분비하는 것으로 보고 되고 있다(Xiraphi et al. 2008). 본 연구에서는 이 균이 감귤의 진피를 발효시킬 수 있는 지 확인하고자 발효액에 B. longum을 접종하고, 여기에 가장 대 표적인 탄소원과 질소원으로 glucose와 peptone을 각각 첨가 하고, 비타민 및 무기질원으로 yeast extract를 첨가시켜 이들 의 품질 특성을 조사하였다. 배양액에 glucose와 yeast extract등을 첨가해 주었을 경우 <Figure 2> 및 <Figure 3> 에서와 같이 yeast extract 1%, peptone 5%, potassium phosphate 0.15%에서 가장 높은 성장률을 나타내었고 glucose의 첨가는 성장에 영향을 미치지 않았다. 한국인들의 김치에서 많이 발견되는 L. mesenteroides가 진피 발효를 시 킬 수 있는지 여부를 확인해 본 바, yeast extract 1%, peptone 5%, potassium phosphate 0.1%를 첨가했을 시 성장 이 가능하였다<Figure 4, 5>. 또한 B. bifidum는 yeast extract 0.5%, peptone 3%, potassium phosphate 0.1%를 첨 가한 경우 빠른 성장을 나타내었고 이 균 역시 glucose는 성 장에 별 영향을 미치지 않았다<Figure 6, 7>.
2.pH 및 적정 산도 변화
이상의 방법으로 제조한 감귤 진피 발효액의 pH와 산도를 측정해 보기 위해 6, 12, 24, 48, 72시간 단위의 시간대 별 로 발효액의 pH 변화를 조사해 본 바, 감귤 진피 발효액의 초기 pH는 5.25로 약산성을 나타냈으나 발효 72시간 후 3.39로 떨어져, 요구르트의 바람직한 pH 범위가 2.37-4.53이 라는 Kroger & Weaver(1973)와 Chamber(1979)의 결과를 고려해 볼 때 감귤 진피도 발효액으로 이용할 수 있음을 확 인할 수 있었다<Table 2>. 발효 과정에서 생산된 젖산과 감 귤에 함유된 각종 유기산에 의해 발효액의 pH가 시간이 경 과함에 따라 떨어졌을 것으로 보이며, 이는 발효액의 보존성 을 높여주는 효과와 더불어 풍미를 좋게 해 주는 장점을 제 공해 줄 것으로 사료된다(Chamber 1979). 감귤 진피 발효액 의 산도는 0.77%에서 발효 72시간 이후에는 4.08%로 증가 하였다. 또 각종 혼합 균주를 사용해 감귤 진피를 발효시키 면 산도가 빠른 속도로 저하됨을 알 수 있었으며, 이는 Kroger & Weaver(1973)가 요구르트 제조 시 probiotics를 2 가지 이상 혼합 배양하면 단독 배양 시보다 산도와 생균수 가 증가한다고 한 결과와도 일치하였다.
3.생균수 측정
감귤 진피 발효액의 살아있는 유산균 수를 확인하기 위해 생균수를 측정해 본 바, 생균수는 발효 72시간 후 7.4×1010 CFU/mL로 나타났으며, 대조군은 1.1×1010 CFU/mL로 측정 되었다<Figure 8>. 또 요구르트의 유통기한이 냉장 보관을 할 경우 통상적으로 2주인 점을 고려하여, 감귤 진피 발효액 을 5°C 냉장고에 2주 보관 후 생균수를 측정해 본 바, 이들 의 생균수가 0.8×1010 CFU/mL로 나타나 균의 생존을 확인 하였고, 이는 식품공전에 제시된 농후발효유의 유산균 수 기 준인 1×108 CFU/mL보다 높음을 알 수 있었다.
4.항균 실험
감귤 진피를 발효시켜 발효액을 만들어도 항균효과가 여 전히 남아 있을 수 있는 지 확인하고자, 식중독 유발 세균 중 저항성이 강한 대표적 균주 중 하나를 선택하여 이들에 대한 항균성을 조사해 보았다. 가금류를 포함한 온혈 동물의 깃털 등에서 발견되어 동물성 식품의 비위생적 처리과정에 서 식중독을 유발하게 되는 Campylobacter jejuni 에 적용시 켜 항균 활성을 검색해 본 바, <Figure 9>와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 8mm paper disc에 점적한 감귤 진피 발효 액의 농도가 증가할수록 clear zone (mm)의 크기가 증가하 였으며, 감귤 진피 발효액 25,000 ppm 농도에서 가장 큰 항 균 활성을 나타내었다. Lee et al.(1991)은 귤 진피 추출물이 Helicobater pylori에 대한 항균 활성을 가진다고 보고한 바 있으나, 이들 추출물을 발효시켰을 때에도 항균력을 가지는 지에 대해서는 조사한 바 없다. 본 연구 결과 감귤의 진피 발효액은 Campylobacter jejuni에 대해 항균력을 가짐을 알 수 있었다.
IV.요약 및 결론
본 연구에는 비타민과 칼슘이 많이 함유된 제주도산 감귤 진피를 이용하여 발효액을 제조하기 위해, 7가지 종류의 probiotics를 접종시키고 각종 영양 성분을 첨가하여 발효시 켰다. B. longum과 B. bifidum 및 L. mesenteroides 균주의 성장이 가장 활발하였으며, 성장을 위한 최적 조건을 찾기 위해 glucose, yeast extract, peptone, potassium phosphate 를 첨가하고 균주의 성장을 관찰하였다. 감귤 진피 추출물에 yeast extract 1%, peptone 5% 및 phosphte 0.1%를 첨가 했을 시 probiotics의 성장율이 가장 높았다. 감귤 진피 발효 액의 pH, 산도, 생균수를 측정한 결과, 감귤 진피 발효액의 초기 pH는 5.25에서 72시간 발효 이후 pH 3.39까지 떨어졌 으며, 산도도 4.08%로 증가하였다. 냉장고에 2주 보관한 감 귤 진피 발효액의 생균수는 1.3×1010 CFU/mL로 식물성 요 구르트 제조에 함유된 기준치보다 높았다. 감귤 진피 발효액 의 항균성을 검증해 본 바, 25,000 ppm 농도에서 Campylobacter jejuni에 대한 항균 활성을 관찰할 수 있었다.
