I. 서 론
비오틴(biotin)은 수용성 비타민 B군에 속하는 필수 미량 영양소로, 인체 내 여러 카복실화 반응에 관여하는 조효소로 작용한다(Pacheco-Alvarez et al. 2002). 비오틴 의존성 효소에는 acetyl-CoA carboxylase, pyruvate carboxylase, propionyl-CoA carboxylase 및 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase 등이 포함되며, 이들 효소는 지방산 합성, 포도당 신생합성 및 아미노산 대사 과정에 관여한다(Tong 2013). 비오틴은 정상적인 에너지 대사 유지에 필요한 영양소이며 결핍 시 피부염, 탈모, 결막염 및 신경학적 증상 등이 나타날 수 있다(Zempleni et al. 2008). 또한 비오틴은 난황, 간, 육류, 어류, 유제품뿐만 아니라 일부 채소류, 견과류 및 곡류 등 다양한 식품에 분포하는 것으로 알려져 있다(Staggs et al. 2004).
식품 중 비타민 함량은 원재료의 품종, 재배 환경, 저장 조건뿐만 아니라 조리 및 가공 과정에 의해서도 변화할 수 있다(Leskova et al. 2006). 조리 과정에서는 가열 조건, 조리 시간, 수분 손실 및 조리수 사용 여부가 영양성분 함량 변화에 영향을 줄 수 있다. 특히 비오틴과 같은 수용성 비타민은 조리수의 용출이나 가열에 따른 손실이 발생할 수 있으므로, 실제 섭취 형태의 함량을 평가하기 위해서는 조리 후 변화를 함께 고려할 필요가 있다(Yuan et al. 2009;Zeng 2013). 조리 방법은 식품에 전달되는 열과 수분의 형태가 다르기 때문에 영양성분 변화에 서로 다른 영향을 줄 수 있다. 삶기와 데치기 같이 물을 사용하는 조리법은 수용성 성분의 용출과 관련될 수 있으며, 찌기는 식품이 조리수에 직접 잠기지 않는 방식이라는 점에서 삶기와 구분된다(Fabbri & Crosby 2016;Lee et al. 2019). 또한 볶기와 굽기와 같은 건식 조리법은 조리수와의 직접적인 접촉은 적지만, 고온 가열과 수분 증발에 따른 식품 매트릭스 변화가 나타날 수 있다(Kim et al. 2022).
한국인의 식생활은 밥, 국, 김치 및 다양한 반찬으로 구성되는 식사 형태를 특징으로 하며, 농식품은 생식뿐만 아니라 삶기, 데치기, 찌기, 볶기, 굽기 등의 조리 과정을 거쳐 섭취되는 경우가 많다(Kim et al. 2016). 특히 나물류는 한국 식생활에서 채소 섭취를 높이는 대표적인 조리⋅섭취 형태로, 식물성 식품을 데치거나 가열한 뒤 양념하여 섭취하는 방식이 널리 활용된다(Kim et al. 2020). 그뿐만 아니라 육류와 난류 역시 가열 조리 후 섭취되는 대표적인 식품군이다. 이처럼 실제 섭취 형태가 조리 과정을 수반하는 경우가 많기 때문에, 한국인의 영양소 섭취량을 보다 정확히 평가하기 위해서는 비조리 식품의 영양성분 자료뿐만 아니라 조리 후 식품의 영양성분 변화와 잔존율을 반영한 자료가 필요하다. 그러나 현재까지 비오틴에 관한 연구는 주로 대사적 기능, 결핍 증상 또는 분석법 확립에 초점을 둔 경우가 많으며(Pacheco-Alvarez et al. 2002;Zempleni et al. 2008;Park et al. 2020), 국내 다소비 농식품을 대상으로 실제 한국 식생활에서 활용되는 조리법을 적용하여 비오틴 함량 변화를 체계적으로 비교한 연구는 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 국내 다소비 농식품을 대상으로 실제 식생활에서 활용되는 대표적인 조리법을 적용하여 조리 전후의 비오틴 함량 변화를 분석하고, 실제 섭취 형태를 반영한 비오틴 식품성분 데이터베이스 구축을 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
II. 연구내용 및 방법
1. 실험재료 및 시약
본 연구에 사용한 농식품 시료와 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology, NIST)의 표준참고물질인 SRM 1549a (Whole milk powder)는 2024년 농촌진흥청으로부터 제공받아 냉장고(C110AHB, LG Electronics Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 –20℃에서 냉동 보관한 후 실험에 사용하였다. 비오틴 표준품, 시료 전처리에 사용한 sodium phosphate monobasic monohydrate, sodium phosphate dibasic dihydrate 및 sodium hydroxide는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 비오틴의 high-performance liquid chromatography (HPLC) 분석에 사용한 이동상 용매인 acetonitrile은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서, o-phosphoric acid는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 내부 분석품질관리에 사용한 in-house quality control (IHQC) 시료는 시판 영아용 분유(Imperial Dream XO, Namyang, Seoul, Korea)를 구입하여 –80℃에서 냉동 보관하였으며, 매 분석 시 함께 사용하였다. 제공받은 시료는 생것, 데친 것, 삶은 것, 찐 것, 볶은 것, 구운 것 등 조리 상태별로 구분되어 있었으며, 각 시료는 균질화한 후 분석에 사용하였다.
2. 비오틴 전처리 및 추출
비오틴의 추출 및 정제는 Yu et al. (2024)의 방법에 따라 수행하였다. 균질화한 시료 약 1-5 g에 추출용매(0.15 M sodium phosphate buffer, pH 7.0) 25 mL를 첨가한 뒤, 고압멸균기(LAC-5080S, Daihan Labtech Co., Ltd., Namyangju, Korea)를 이용하여 121℃에서 25분간 추출하였다. 추출 후 시료는 실온에서 냉각하였으며, 동일한 추출용매 25 mL를 추가하여 총 부피를 50 mL로 맞추었다. 추출액은 원심분리기(FLETA-5, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Incheon, Korea)를 이용하여 실온에서 10분간 1,610×g로 원심분리한 뒤, Whatman No. 2 filter paper (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 여과하였다. 이후 냉장 보관된 immunoaffinity column (Easi-Extract Biotin, R-Biopharm, Darmstadt, Germany)을 실온에서 30분간 방냉한 후, phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.0) 5 mL, 시료 추출액 10 mL, PBS 5 mL 및 3차 증류수 5 mL를 순차적으로 흘려주었다. 이후 methanol 4 mL를 가하여 해당 컬럼에 흡착된 비오틴을 용출한 뒤 시험관에 수집하였다. 용출액은 질소농축기(MG-2200, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 methanol을 제거한 후, 3차 증류수로 재용해하여 HPLC 분석에 사용하였다.
3. 비오틴 HPLC 분석
비오틴의 HPLC 분석은 Yu et al. (2024)의 방법에 따라 수행하였다. 비오틴 분석은 HPLC (Chromaster 5000 series, Hitachi, Tokyo, Japan)와 Kinetex Phenyl-Hexyl column (150 × 4.6 mm, 2.6 µm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 검출기는 UV detector를 사용하였고, 검출 파장은 200 nm로 설정하였다. 이동상은 용매 A로 100% acetonitrile, 용매 B로 0.1% o-phosphoric acid in water, 용매 C로 80% acetonitrile을 사용하였다. 주입량, 컬럼 온도, 유속 및 gradient 조건을 포함한 비오틴의 HPLC 분석 조건은 <Table 1>에 나타내었다.
4. 비오틴 표준용액의 조제
비오틴 정량을 위한 표준용액은 3차 증류수에 비오틴 표준품을 희석하여 0.008, 0.015, 0.030, 0.060, 0.120, 0.240, 0.480 및 0.960 µg/mL의 농도로 조제하였다. HPLC 분석 후 작성한 검량선에 시료의 peak area 값을 대입하여 비오틴 함량을 계산하였다.
5. 비오틴 분석법 검증
본 연구에서는 비오틴 분석법의 민감도를 평가하기 위해 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)를 산출하였다. LOD와 LOQ는 각각 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, S/N)가 3 및 10이 되는 기준을 적용하여 설정하였다. 분석의 정확도는 NIST에서 제공하는 표준참고물질(SRM 1549a)의 참고값 대비 회수율(%)과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD, %)를 통해 확인하였다. 분석법의 정밀도는 IHQC 시료를 이용하여 평가하였으며, 동일한 날에 5회 반복 분석하여 일내정밀도(intra-day precision)를 확인하고, 서로 다른 날짜에 1회씩 5일간 분석하여 일간정밀도(inter-day precision)를 확인하였다.
6. 비오틴 분석의 내부 분석품질관리
내부 분석품질관리는 IHQC 시료를 이용하여 수행하였다. QC chart 작성을 위해 해당 시료를 10회 이상 반복 분석하였으며, 평균 ± 2 × 표준편차를 관리 상⋅하한선(upper control limit, UCL; lower control limit, LCL), 평균 ± 3 × 표준편차를 조치 상⋅하한선(upper action limit, UAL; lower action limit, LAL)으로 설정하였다. 모든 분석 시 IHQC 시료를 함께 분석하여 분석값이 설정된 관리 범위 내에 포함되는지 확인하였다.
7. 통계분석
본 연구의 비오틴 함량은 2회 이상 반복 측정한 값을 기반으로 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 처리는 SAS software (version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 수행하였다. 시료 간 유의적인 차이를 확인하기 위해 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 이용하였다. 모든 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
III. 결과 및 고찰
1. 비오틴 분석법 검증 및 내부 분석품질관리
비오틴 분석법의 검증을 위해 비오틴 표준물질을 이용하여 작성한 표준곡선은 0.999 이상의 결정계수(R2)를 나타내어 우수한 직선성을 보였다 <Figure 1>. 비오틴의 분석 감도는 S/N을 기준으로 LOD와 LOQ를 산정하였다. LOD와 LOQ는 각각 S/N이 3 및 10에 해당하는 농도로 설정하였으며, LOD는 0.008 µg/mL, LOQ는 0.021 µg/mL로 확인되었다 <Table 2>. 비오틴 분석 정확도는 NIST 표준참고물질 SRM 1549a를 대상으로 회수율(%)과 RSD를 통해 평가하였다. SRM 1549a의 참고값은 0.152±0.016 mg/kg이며, 본 연구에서 측정된 분석값은 0.152±0.000 mg/kg으로 나타났다. 이에 따른 회수율은 100.013%였으며, RSD는 0.08%로 낮게 나타나 분석 정확도가 우수함을 확인하였다 <Table 3>. 또한, 분석 정밀도는 IHQC 시료를 이용하여 일내정밀도와 일간정밀도로 나누어 평가하였다. 일내정밀도 평가는 동일 시료를 하루 동안 5회 반복 분석하여 수행하였으며, 평균값은 35.477 µg/100 g, SD는 0.694, RSD는 1.957%로 나타났다. 일간정밀도 평가는 동일 시료를 서로 다른 날짜에 1회씩 5일간 분석하여 수행하였고, 평균값은 34.751 µg/100 g, SD는 1.446, RSD는 4.162%로 나타났다 <Table 4>. Park et al. (2020)은 immunoaffinity-HPLC/PDA를 이용한 비오틴 분석법 검증에서 R2=0.9998의 직선성과 SRM 1549a에 대한 100.2%의 회수율을 보고하였으며, 반복성 및 재현성의 변동계수는 각각 3.6% 및 4.9%로 나타나 분석법의 정확도와 정밀도가 확보되었음을 확인하였다. 본 연구에서도 SRM 1549a에 대한 회수율이 100.013%로 나타났고, 일내 및 일간정밀도의 RSD가 각각 1.957% 및 4.162%로 낮게 나타나 선행연구와 유사하게 비오틴 정량분석에 적합한 분석 신뢰성을 확보한 것으로 판단된다. 또한, 본 연구에서는 내부 분석품질관리를 목적으로 IHQC 시료를 사용하였으며, 해당 시료를 10회 이상 반복 분석한 데이터를 바탕으로 LCL과 UCL, LAL과 UAL을 설정하였다. 이를 토대로 QC chart를 작성하고, 모든 분석 과정에서 QC 시료를 함께 분석하여 결과의 신뢰성을 확보하고자 하였다 <Figure 2>. 본 분석에 사용된 QC chart의 LCL과 UCL은 각각 33.961 및 39.798 µg/100 g, LAL과 UAL은 각각 32.501 및 41.257 µg/100 g으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 사용한 비오틴 분석은 직선성, 정확도, 정밀도 및 내부 품질관리 기준을 모두 충족하였고, 재현성 및 신뢰성이 확보된 정량 분석법으로 판단된다.
2. 조리 방법에 따른 식물성 식품의 비오틴 함량 변화
본 연구에서 분석한 채소⋅버섯류, 곡류⋅서류, 견과⋅종실⋅두류의 조리 방법에 따른 비오틴 함량 변화는 <Table 5>에 나타내었다. 채소⋅버섯류의 생것 시료 중 수리취 잎이 4.828±0.020 µg/100 g으로 가장 높은 비오틴 함량을 나타냈으며, 다음으로 배초향 잎이 2.418±0.041 µg/100 g으로 높게 나타났다. 특히 말린 줄기상추는 11.408±0.288 µg/100 g으로 식물성 식품군 중 가장 높은 함량을 나타내었다. 이는 건조 과정에서 수분이 제거되면서 단위 중량당 고형분 비율이 증가하고, 이에 따라 비오틴 함량이 상대적으로 높게 나타난 결과로 사료된다(Sablani 2006). 그러나 말린 줄기상추를 물에 불려 삶았을 때 함량은 0.721±0.002 µg/100 g으로 약 93.7% 감소하였으며, 토란대 역시 말린 것(3.661±0.009 µg/100 g)에 비해 물에 불려 삶은 후 0.944±0.001 µg/100 g으로 약 74.2% 감소하였다. 이러한 결과는 물을 사용하는 조리 과정에서 수용성 비타민이 조리수로 용출되거나 가열 조건에 따라 손실될 수 있다는 보고와 유사한 경향을 보였다(Rickman et al. 2007). 또한 Yu et al. (2024)의 연구에서도 말린 농식품의 비오틴 함량이 상대적으로 높게 나타났으며, 끓이거나 데치는 조리 후 일부 시료에서 비오틴 함량이 감소하는 경향이 보고되었다. 반면 미니오이는 생것(0.290±0.008 µg/100 g)에 비해 찐 시료에서 1.410±0.001 µg/100 g으로 약 4.9배 높은 함량을 나타내었다. 이는 증기를 이용한 간접 가열 과정에서 식품 조직이 연화되어 분석 과정에서 비오틴의 추출 효율이 증가했거나, 조리 중 수분 손실에 따른 상대적 농축 효과가 작용한 결과로 생각된다(Miglio et al. 2008). 한편 섬초와 일부 오이 시료 등에서는 비오틴이 검출되지 않았는데, 이는 동일 식품군 내에서도 식품 종류와 매트릭스 특성에 따라 비오틴 함량 차이가 나타날 수 있음을 보여준다. 곡류⋅서류의 경우, 쌀눈은 생것에서 7.366-8.002 µg/100 g으로 높은 함량을 보였으며, 찐 시료에서는 2.676-2.684 µg/100 g으로 감소한 반면, 볶은 시료에서는 5.982-7.528 µg/100 g으로 상대적으로 높은 수준을 유지하였다. 이는 수분을 매개로 한 가열 과정에서는 수용성 비타민의 용출 또는 손실이 발생할 수 있는 반면, 볶기와 같은 건식 조리에서는 조리수로의 용출이 제한되기 때문으로 판단된다. 또한 쌀 조리 과정에서도 조리 방법에 따라 수용성 B군 비타민의 함량 변화가 다르게 나타나는 것으로 보고되어 있어, 곡류의 비타민 잔존에는 가열 방식과 수분 사용 여부가 중요한 요인으로 작용할 수 있다(Rezaei et al. 2022). 견과⋅종실⋅두류에서는 검정깨 가루가 10.923±0.047 µg/100 g으로 높은 함량을 나타내었다. 검정깨는 생것(5.655±0.075 µg/100 g)과 볶은 것(5.647±0.056 µg/100 g)에서 유사한 함량을 보였으나, 가루 형태에서는 생것보다 약 1.9배 높게 나타났다. 검정깨 가루의 높은 비오틴 함량은 분쇄에 따른 입자 크기 감소와 조직 구조의 파괴로 용매와의 접촉 면적이 증가하여 비오틴 추출성이 향상되었기 때문일 가능성이 있다. Alsaud & Farid (2020)는 식물 시료의 분쇄 및 입자 크기 감소가 세포벽 파괴와 확산성 증가를 통해 생리활성 성분의 추출 효율을 높일 수 있다고 보고하였다. 반면 렌틸콩은 생것과 삶은 것 모두에서 비오틴이 검출되지 않았으며, 이는 동일 식품군 내에서도 식품 종류와 매트릭스 특성에 따라 비오틴 함량 차이가 클 수 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서는 식물성 식품군의 비오틴 함량을 알아보았으며, 식품의 종류뿐만 아니라 건조, 삶기, 찌기, 볶기 및 분쇄와 같은 조리 및 가공 방법에 따라 비오틴의 함량이 달라질 수 있음을 확인하였다.
3. 조리 방법에 따른 동물성 식품의 비오틴 함량 변화
본 연구에서 분석한 육류 및 난류의 조리에 따른 비오틴 함량 변화는 <Table 6>에 나타내었다. 육류 중 닭고기는 부위에 관계없이 생것보다 조리 후 비오틴 함량이 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히 닭 목살을 팬에 구웠을 때 2.659±0.028 µg/100 g으로 육류 시료 중 가장 높은 함량을 나타내었으며, 닭 안심과 닭다리살에서도 삶은 시료, 오븐에 구운 시료 및 팬에 구운 시료의 비오틴 함량이 생것보다 높게 나타났다. 이는 육류 가열 과정에서 단백질 변성과 수분 손실이 발생하고, 그에 따른 농축 효과가 반영된 결과로 판단된다(Tornberg 2005). 반면, 소의 내장류인 천엽과 위는 생것에 비해 삶은 후 각각 81.3%, 71.9% 감소하였다. 이는 물을 사용하는 삶기 조리 과정에서 비오틴 또는 가용성 성분의 손실이 발생한 결과로 사료된다(Rickman et al. 2007). 소의 간은 생것(1.609±0.012 µg/100 g), 삶은 것(1.503±0.016 µg/100 g), 구운 것(1.598±0.023 µg/100 g)이 1.503-1.609 µg/100 g 범위로 나타나 조리 후 변화가 상대적으로 작았다. 간을 포함한 동물성 내장류는 비오틴 함량이 비교적 높은 식품군으로 보고되어 있으며, 식품 내 비오틴의 일부는 펩타이드 및 단백질과 결합된 형태로 존재할 수 있다(Watanabe et al. 2014). 소 간에서 조리 후 비오틴 함량 변화는 비교적 적은 것으로 나타났으며, 이는 간 조직 내 비오틴이 단백질 결합형 또는 안정적인 형태로 존재하여 가열 및 조리 과정에서도 비교적 안정하게 유지되었기 때문으로 판단된다. 본 연구에서 가장 높은 비오틴 함량을 보인 시료는 삶은 유정란 노른자로, 77.455±0.692 µg/100 g으로 나타났다. 이는 생 유정란 노른자(66.517±0.349 µg/100 g)보다 유의적으로 높았으며, 이는 가열에 따른 난황 성분과 비오틴 결합 단백질의 구조 변화로 비오틴 추출성이 증가했을 가능성이 있다(White et al. 1976;Wang et al. 2023). 반면, 구운 달걀 전란의 비오틴 함량은 36.494±0.267 µg/100 g으로 삶은 달걀 전란(48.669±0.529 µg/100 g)보다 낮게 나타났다. 또한 구운 달걀의 흰자와 노른자는 각각 33.980±0.047 및 38.723±0.369 µg/100 g으로, 삶은 달걀의 흰자와 노른자 각각 7.673±0.001 및 63.742±0.234 µg/100 g과 다른 양상을 보였다. 이는 난류에서 조리법과 부위에 따라 비오틴 함량 변화 양상이 다른 것을 보여준다. 본 연구에서는 조리법에 따른 동물성 식품의 비오틴 함량을 알아보았으며, 식품의 종류와 조리 조건에 따라 비오틴의 변화 특성이 다르게 나타남을 확인하였다.
IV. 요약 및 결론
본 연구에서는 국내 다소비 농식품을 대상으로 실제 한국 식생활에서 활용되는 조리법을 적용하여 조리 전후 비오틴 함량 변화를 분석하고, 분석법의 신뢰성을 검토하였다. 비오틴은 sodium phosphate buffer로 추출한 후 immunoaffinity column을 이용하여 정제하였으며, high-performance liquid chromatography를 이용하여 분석하였다. 분석법 검증 결과, 표준곡선은 0.999 이상의 결정계수(R2)를 나타내어 우수한 직선성을 보였고, 검출한계와 정량한계는 각각 0.008 및 0.021 µg/mL로 확인되었다. SRM 1549a에 대한 회수율은 100.013%였으며, 일내정밀도와 일간정밀도의 RSD는 각각 1.957% 및 4.162%로 나타나 분석법의 정확도와 정밀도를 확인하였다. 식물성 식품에서는 말린 줄기상추가 11.408 µg/100 g으로 가장 높은 비오틴 함량을 보였으나, 물에 불려 삶은 후에는 약 93.7% 감소하였다. 쌀눈과 검정깨 가루에서도 비교적 높은 함량이 확인되었으며, 미니오이는 찐 시료에서 생것보다 약 4.9배 높은 함량을 보였다. 동물성 식품에서는 닭고기가 조리 후 대체로 생것보다 높은 비오틴 함량을 보였고, 소의 천엽과 위는 삶은 후 크게 감소하였다. 전체 시료 중 삶은 유정란 노른자가 77.455 µg/100 g으로 가장 높은 비오틴 함량을 나타냈으며, 구운 달걀 전란은 삶은 달걀 전란보다 낮은 함량을 보였다. 본 연구 결과는 실제 섭취 형태를 반영한 비오틴 식품성분 데이터베이스 구축을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 다만 일부 식품에서는 조리 전후 비교가 제한적이므로, 향후 다양한 식품과 조리 방법을 대상으로 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
