I. 서론
고령화 사회의 급속한 진행과 함께 노인 인구의 건강한 삶의 질 유지에 대한 사회적 관심이 높아지고 있으며, 이와 관련하여 식생활이 건강 유지 및 질병 예방에 미치는 역할이 더욱 중요하게 인식되고 있다. 특히 근육 건강은 노년기 신체 기능 유지의 핵심 요소로, 적절한 영양 섭취와 식이 패턴이 근육량 및 근력 보존에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다(Kim et al. 2023). 이러한 맥락에서 식품 및 천연물 유래 소재를 활용한 근육 건강 증진 연구는 약물 치료의 대안으로서 안전성과 지속 가능성 측면에서 주목받고 있으며, 일상적인 식이를 통해 예방적 효과를 기대할 수 있다는 점에서 식생활문화 분야의 중요한 연구 주제로 자리매김하고 있다.
골격근(skeletal muscle)은 인체 체중의 약 40-50%를 차지하며, 신체 운동 및 자세 유지뿐만 아니라 에너지 대사 조절에서도 핵심적인 역할을 수행한다. 그러나 노화가 진행됨에 따라 근육량과 근력이 점진적으로 감소하는 근감소증(sarcopenia)이 나타나게 된다. 근감소증은 노화에 따른 근육량 감소와 더불어 근력 및 신체 기능 저하가 동반되는 복합적인 질환으로(Cruz-Jentoft et al. 2019), 세계보건기구(WHO)는 2017년에 근감소증에 질병분류 코드를 부여하였으며, 한국에서도 2021년 제8차 한국표준질병 사인분류에 근감소증 질환 코드(M62.5)가 포함되었다(Kim et al. 2024). 근육량은 30대부터 서서히 감소하기 시작하여 50세 이후에는 매년 1-2%씩 소실되며, 70대에는 최대 절반 수준까지 줄어드는 것으로 알려져 있다(Janssen et al. 2000). 근감소증은 단순한 근육 소실에 그치지 않고 낙상·골절 위험 증가, 제2형 당뇨병, 심뇌혈관 질환 등 심각한 합병증으로 이어지며, 입원 및 장기 치료의 필요성을 높이고 궁극적으로 사망 위험까지 증가시키는 요인으로 보고되고 있다(Chen et al. 2020).
골격근의 분화와 성장은 근육 조절 인자(myogenic regulatory factors, MRFs)에 의해 정밀하게 조절된다. 그 중 MyoD는 근세포 분화의 초기 단계를 조절하는 핵심 전사인자로, 근육 특이적 유전자 발현을 유도하고 근원세포(myoblast)가 근관세포(myotube)로 분화하는 과정을 촉진한다(Battistelli et al. 2022). Myogenin은 MyoD와 함께 작용하며 후기 근육 분화 과정에서 근육 특이적 유전자의 전사를 활성화하는 데 필수적인 역할을 담당한다(Adhikari et al. 2021). 이러한 MRFs의 순차적 발현은 근세포의 성숙과 근섬유 형성에 결정적으로 기여하며, 이들의 발현 조절이 근감소증의 예방 및 치료를 위한 중요한 분자적 표적으로 주목받고 있다. 한편, 근육의 단백질 합성은 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로를 통해 조절되며, 이 경로는 근비대(muscle hypertrophy) 유도와 근위축 억제에 핵심적인 역할을 수행한다(Leite et al. 2021). PI3K의 활성화는 Akt를 인산화시키고, 이는 mTOR를 활성화하여 하위 표적 단백질인 p70S6K의 인산화 및 4EBP1의 조절을 통해 단백질 번역(translation)을 촉진한다(Laplante & Sabatini 2012). 또한 세포골격 단백질인 Desmin은 근섬유 구조의 안정성과 기계적 완결성을 유지하는 데 필수적인 중간 필라멘트 단백질로(Hnia et al. 2015), Desmin의 발현 수준은 근섬유의 성숙도와 밀접하게 연관되어 있다. 한편, 후성유전 조절 인자인 PRMT7은 p38 MAPK의 아르기닌 잔기를 메틸화함으로써 MyoD 활성을 증강시키고 근원세포 분화를 촉진하는 것으로 보고되었다(Jeong et al. 2020).
근감소증 예방을 위한 식품 및 천연물 유래 소재에 관한 연구는 최근 빠르게 증가하고 있다. 포도에서 유래한 폴리페놀 화합물인 resveratrol은 C2C12 근원세포에서 myogenin 등 근육 분화 마커의 발현을 상향 조절하고 myotube 형성을 촉진하는 것으로 보고되었다(Montesano et al. 2013). 채소 및 과일에 풍부하게 함유된 플라보노이드인 quercetin은 C2C12 세포에서 AKT 신호 경로를 활성화하여 근원세포의 이동 및 분화를 유도하고, 근위축 관련 단백질인 MuRF-1 및 atrogin-1의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다(Hour et al. 2022). 또한 꿀풀과(Lamiaceae) 식물에 풍부하게 함유된 페놀산 화합물인 rosmarinic acid는 C2C12 근원세포에서 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 및 세포자멸사를 억제하고 세포 생존율을 유의하게 향상시키는 것으로 나타났다(Choi 2022). 더불어 로즈마리 추출물은 MyoD 및 myogenin 발현을 증가시키는 동시에 근위축 관련 인자의 발현을 억제함으로써 근감소증 예방 소재로서의 가능성이 보고되었다(Kim et al. 2023). 이처럼 일상적으로 섭취하는 식품 유래 천연물에서 근육 건강 관련 생리활성을 규명하는 연구는 식생활을 통한 근감소증 예방 전략의 과학적 근거를 제공한다는 점에서 식생활문화 분야에서 매우 중요한 의미를 가진다.
Mentha suaveolens Ehrh.(애플민트, MS)는 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 다년생 방향성 허브로, 지중해 지역을 비롯하여 유럽, 아시아 등지에서 전통 의약 재료로 사용되어 왔다(Božović et al. 2015). 식품소재로서 애플민트는 독특한 사과향을 지닌 온화한 풍미로 허브티, 샐러드, 디저트, 육류 요리 등에 폭넓게 활용되며, 페퍼민트에 비해 자극이 적어 다양한 연령층이 부담 없이 섭취할 수 있는 식재료로 선호도가 높다(Mamadalieva et al. 2020). 최근 건강기능성 허브에 대한 소비자 관심이 증가하면서 애플민트와 같은 방향성 허브 식물의 식품 소재로서의 활용 가능성에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한 애플민트는 rosmarinic acid, quercetin, rutin 등 근육세포 보호 및 항산화 효능이 알려진 폴리페놀 화합물을 다량 함유하고 있어 기능성 식품 소재로서의 가치가 높다(Tavaszi-Sárosi et al. 2025). 생리활성 측면에서는 항균, 항진균, 항염증, 항산화 및 간 보호 효과 등 광범위한 활성을 지닌 것으로 알려져 있으며(Lee et al. 2019), 특히 수성 추출물이 인간 섬유아세포에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs) 및 인터루킨-8(interleukin-8, IL-8)의 생성을 억제함으로써 항열노화 효과를 나타내는 것이 보고되었다(Son et al. 2018). 그러나 현재까지 애플민트 추출물이 근육세포의 분화 및 단백질 합성에 미치는 영향에 대한 연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 연구에서는 식용 허브로 널리 이용되고 있는 애플민트 추출물이 C2C12 근육세포의 분화 및 myotube 형성에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 근육 분화 관련 단백질(MyoD, Myogenin), 단백질 합성 관련 신호전달 단백질(PI3K, p-p70S6K, 4EBP1), 그리고 근육 성숙 관련 단백질(Desmin, PRMT7)의 발현 변화를 분석함으로써 애플민트 추출물의 근육 건강 증진 효과를 규명하고자 하였다. 이를 통해 애플민트의 기능성 식품 소재로서의 활용 가능성을 검토하고, 건강한 식생활을 통한 근육 건강 관리에 기여할 수 있는 과학적 근거를 마련하고자 하였다.
II. 연구 내용 및 방법
1. 재료
본 연구에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS), penicillin-streptomycin (PS) 및 phosphate-buffered saline (PBS)은 Gibco (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blot 분석에 사용된 항체는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
2. Mentha suaveolens Ehrh (MS) 추출물 제조
본 연구에 사용한 애플민트(Mentha suaveolens Ehrh.)는 충청남도 홍성군에서 재배된 원료를 사용하였다. 애플민트의 잎 부분을 분리하여 증류수로 세척한 후 50℃에서 열풍 건조하여 분말화하였다. 건조된 시료에 70% ethanol을 가하여 70℃에서 3시간씩 2회 추출하였으며, 추출액은 여과하여 상등액을 회수하였다. 회수한 추출액은 회전감압농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 분말 형태의 추출물을 제조하였다. 최종 추출 수율은 원료 건조중량 대비 21.41%로 나타났다. 제조된 추출물은 -20℃에서 보관하였으며, 세포실험에 사용하기 위해 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였다.
3. 세포배양 및 분화유도
마우스 유래 근육 전구세포주인 C2C12 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin-streptomycin (PS)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포가 80-90% confluence에 도달하면 배지를 2% horse serum (HS)이 포함된 분화배지로 교체하여 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하였다. MS 추출물은 분화 유도 시작 시점(Day 0)에 최종 농도 50 µg/mL로 처리하였으며, Day 2 및 Day 4에 시료가 포함된 분화배지로 교체하였다. 세포는 총 5일간 분화시킨 후 수확하여 실험에 사용하였다<Figure 1>.
4. 세포 생존율 평가
MS 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. C2C12 세포를 96-well plate에 1.5×104 cells/well의 밀도로 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 MS 추출물을 최종 농도 1, 5, 10, 25, 50, 100 및 200 µg/mL로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 MTT 용액(0.1 mg/mL)을 각 well에 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 생성된 formazan crystal은 DMSO를 이용하여 용해한 후 microplate reader를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군의 흡광도를 기준으로 백분율(%)로 환산하여 나타내었다.
5. Myotube 형성 관찰
MS 추출물이 C2C12 세포의 분화 및 myotube 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 광학 현미경을 이용하여 세포 형태를 관찰하였다. 분화 유도 5일 후 세포를 PBS로 세척한 다음 광학 현미경으로 관찰하였다. 세포 이미지는 200배 배율에서 촬영하였으며, myotube의 형성 정도, 길이, 직경 및 배열 상태를 비교 분석하였다.
6. Western blot을 통한 단백질 발현
MS 처리에 따른 근육 분화 및 단백질 합성 관련 신호전달 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여 Western blot 분석을 수행하였다. C2C12 세포를 lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 용해한 후 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 정량된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후 PVDF membrane으로 전이하였다. Membrane은 5% bovine serum albumin (BSA)으로 blocking한 후 4EBP1 (#9644), PI3K p85 (#4292), phospho-p70S6K (Thr389, #9234), p70S6K (#2708), PRMT7 (#8699), Desmin (#5332) 및 β-actin (sc-47778)에 대한 1차 항체와 4℃에서 overnight 반응시켰다. 이후 HRP-conjugated 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시킨 후 ECL detection reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. 단백질 발현량은 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 정량하였으며, β-actin을 기준으로 정규화하였다.
7. 통계분석
모든 실험 결과는 3회 이상 독립적으로 수행하였으며, 결과는 평균(mean)±표준오차(standard error of the mean, SEM)로 나타내었다. 통계분석은 GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 실험군 간의 유의성 검정은 unpaired t-test with Welch's correction을 이용하여 분석하였으며, p<0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
III. 결과 및 고찰
1. MS추출물의 C2C12 세포 분화 및 Myotube 형성 촉진 효과
근육세포의 분화는 근육 재생 및 근육량 유지에 중요한 과정으로 알려져 있으며(Charge & Rudnicki 2004), MyoD와 Myogenin은 근육세포의 분화 과정을 조절하는 대표적인 근육조절인자(myogenic regulatory factors)이다(Rudnicki et al. 1993;Sabourin & Rudnicki 2000). 따라서 본 연구에서는 MS 추출물이 C2C12 세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 myotube 형성 및 근육 분화 관련 단백질의 발현을 분석하였다.
먼저 MS 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여 C2C12 세포에 다양한 농도의 MS 추출물을 24시간 처리한 후 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, MS 추출물은 시험한 농도 범위에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 대부분의 처리 농도에서 대조군 대비 세포 생존율이 유의적으로 증가하였다<Figure 2A>. 특히 50 µg/mL 처리군에서 가장 높은 세포 생존율(127%)을 나타내어 이후 근육 분화 실험 농도로 선정하였다. MS 추출물을 50 µg/mL 농도로 처리하여 5일간 분화를 유도한 결과, 대조군에 비해 myotube 형성이 증가한 것으로 나타났다<Figure 2B>. 특히 MS 추출물 처리군에서는 myotube의 길이와 직경이 증가하였으며, 세포 간 융합 및 배열이 향상된 형태를 나타내었다. 근육세포 분화 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 MyoD 단백질의 발현을 확인한 결과, MS 추출물 처리군에서 대조군 대비 1.86배 증가한 것으로 나타났다<Figure 2C>. 또한 근육세포의 후기 분화 및 myotube 형성에 중요한 역할을 하는 Myogenin 단백질의 발현 역시 MS 추출물 처리군에서 1.49배 증가한 것으로 나타났다<Figure 2D>. 본 연구에서 확인된 MS 추출물의 MyoD 및 Myogenin 발현 증가와 myotube 형성 촉진 효과는 기존 식품 유래 천연물의 근육 분화 촉진 효과와 유사한 경향을 나타내며, MS 역시 근육 건강 증진을 위한 기능성 식품 소재로 활용될 가능성을 시사한다.
2. MS 추출물의 PI3K/p70S6K 신호전달 경로 조절 효과
근육세포의 성장과 분화 과정에서는 활발한 단백질 합성이 요구되며, 이러한 과정은 PI3K/Akt/mTOR 신호전달 경로에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Bodine et al. 2001;Glass 2005). 특히 PI3K의 활성화는 하위 신호전달 인자인 p70S6K 및 4EBP1을 조절함으로써 단백질 번역과 세포 성장을 유도하는 것으로 보고되고 있다(Rommel et al. 2001). 이에 본 연구에서는 MS 추출물이 근육 분화 초기 단계에서 단백질 합성 관련 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분화 유도 3일 후 PI3K, p-p70S6K 및 4EBP1의 단백질 발현을 분석하였다. Western blot 분석 결과, MS 추출물 처리군에서 PI3K, p-p70S6K 및 4EBP1의 단백질 발현이 전반적으로 증가하는 양상을 나타내었다<Figure 3A>. 정량 분석 결과, PI3K의 발현은 대조군 대비 2.27배 증가하였으며, p-p70S6K/p70S6K 비율 또한 2.24배 증가한 것으로 확인되었다. 아울러 4EBP1의 발현 역시 대조군 대비 1.22배 높은 수준을 나타내었다<Figure 3B>.
PI3K는 근육세포의 성장과 단백질 합성을 조절하는 주요 상위 신호전달 인자로 알려져 있으며, p70S6K는 단백질 번역 및 근육 성장에 직접적으로 관여하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 MS 추출물 처리에 의해 PI3K와 p70S6K의 발현이 증가한 결과는 근육세포 내 단백질 합성 관련 신호전달 체계가 활성화되었음을 시사한다. 또한 4EBP1의 발현 증가 역시 단백질 번역 조절 과정에 영향을 미칠 가능성을 보여주는 결과로 판단된다. 이러한 결과는 quercetin 및 resveratrol과 같은 식품 유래 생리활성 성분이 근육세포의 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미친다는 기존 연구 결과와 유사한 경향을 나타낸다(Hour et al. 2022;Montesano et al. 2013). 본 연구에서 확인된 PI3K, p-p70S6K 및 4EBP1의 발현 증가는 MS 추출물이 근육세포의 단백질 합성과 분화 과정에 관여할 가능성을 보여준다. 따라서 MS 추출물은 근육 건강 유지 및 증진을 위한 기능성 식품 소재로서 활용 가치가 있을 것으로 사료된다.
3. MS 추출물의 근육 분화 및 성숙 관련 단백질 발현 효과
근육세포의 분화가 진행됨에 따라 근육 구조 단백질의 발현은 점차 증가하며, 이는 근육세포의 성숙과 근관(myotube) 형성 정도를 반영하는 중요한 지표로 활용된다. Desmin은 골격근의 구조적 안정성을 유지하는 대표적인 중간섬유 단백질로 근육 분화 과정에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있으며(Hnia et al. 2015), PRMT7은 근육 줄기세포의 재생능 유지와 근육세포 분화 조절에 관여하는 인자로 보고되고 있다(Blanc et al. 2016;Jeong et al. 2020). 따라서 본 연구에서는 MS 추출물이 근육세포의 분화 및 성숙 과정에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분화 유도 5일 후 Desmin 및 PRMT7의 단백질 발현을 분석하였다. Western blot 분석 결과, MS 추출물 처리군에서 Desmin 및 PRMT7의 단백질 발현이 증가하는 양상을 나타내었다<Figure 4A>. 이를 정량 분석한 결과, Desmin의 발현은 대조군 대비 2.12배 증가하였으며, PRMT7의 발현은 1.44배 증가한 것으로 확인되었다<Figure 4B>. Desmin은 근육세포의 구조적 완성도와 myotube 형성 정도를 반영하는 분화 표지자로 알려져 있으므로, MS 추출물 처리에 따른 Desmin 발현 증가는 C2C12 세포의 분화 및 성숙이 촉진되었음을 시사한다. 또한 PRMT7의 발현 증가는 근육세포의 재생 및 분화 조절과 관련된 세포 내 기전이 활성화되었을 가능성을 보여준다.
특히 앞서 확인된 MyoD 및 Myogenin의 발현 증가와 함께 Desmin 및 PRMT7의 발현이 증가한 점은 MS 추출물이 근육세포의 분화 유도뿐만 아니라 분화 이후의 성숙 과정에도 관여할 수 있음을 시사한다. Desmin은 근육 분화 과정에서 발현이 증가하는 대표적인 근육 구조 단백질로 알려져 있으며(Hnia et al. 2015), PRMT7은 근육세포의 분화 및 재생능 유지에 관여하는 후성유전 조절 인자로 보고되고 있다(Blanc et al. 2016;Jeong et al. 2020). 따라서 본 연구 결과는 MS 추출물이 근육세포의 구조적 성숙과 기능적 발달을 촉진하여 보다 안정적인 근관 형성에 기여할 수 있음을 보여주며, 근육 건강 증진을 위한 식품 유래 소재로서의 활용 가능성을 뒷받침하는 결과로 판단된다.
IV. 요약 및 결론
본 연구에서는 애플민트(Mentha suaveolens Ehrh., MS) 추출물이 C2C12 근육세포의 분화 및 근육 형성에 미치는 영향을 평가하였다. C2C12 세포를 분화 유도한 후 MS 추출물(50 µg/mL)을 처리하여 myotube 형성 및 근육 분화 관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, MS 추출물은 C2C12 세포의 myotube 형성을 촉진하였으며, 근육 분화 초기 단계의 주요 조절인자인 MyoD와 Myogenin의 발현을 각각 1.86배 및 1.49배 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 분화 유도 3일 후 분석한 PI3K, p-p70S6K/p70S6K 및 4EBP1의 발현은 각각 2.27배, 2.24배 및 1.22배 증가하여 근육 단백질 합성과 관련된 신호전달 경로가 활성화되었음을 확인하였다. 분화 유도 5일 후에는 근육 분화 및 성숙 관련 단백질인 Desmin과 PRMT7의 발현이 각각 2.12배 및 1.44배 증가하여 근육세포의 구조적 성숙과 분화 과정이 촉진됨을 확인할 수 있었다. 결과를 종합해 볼 때, MS 추출물은 근육 분화 조절 인자인 MyoD와 Myogenin의 발현을 증가시키고, PI3K/p70S6K 신호전달 경로를 활성화하며, Desmin 및 PRMT7의 발현을 촉진함으로써 C2C12 세포의 분화 및 성숙에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다. 따라서 MS 추출물은 근육 건강 증진 및 근육 기능 유지에 활용 가능한 기능성 식품 소재로서의 잠재력을 지닌 것으로 사료된다.
