I. 서론

청력 손실은 전 세계적으로 높은 유병률을 보이는 주요 감각 장애 중 하나로, 인구 고령화와 환경적 요인의 증가에 따라 그 발생이 지속적으로 증가하고 있다. 주요 원인으로는 노화, 과도한 소음 노출, 감염, 유전적 요인, 그리고 약물에 의한 독성 등이 있다(Cunningham and Tucci 2017;Olusanya, Davis, and Hoffman 2019). 이러한 다양한 병인에도 불구하고, 난청의 공통적 특징은 내이(inner ear), 특히 와우 내 감각세포 및 나선신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)의 손상으로 나타난다(Liberman and Kujawa 2017). 와우 유모세포(cochlear hair cell)는 음향 자극을 전기적 신호로 변환하는 mechanoelectrical transduction의 핵심 세포이며, 생성된 신호는 내이 유모세포(inner hair cell)의 ribbon synapse를 통해 SGN으로 전달된 후 중추신경계로 전달된다(Fettiplace and Kim 2014). 그러나 포유류의 와우 유모세포는 자발적인 재생 능력이 거의 없어, 손상 이후 증식이나 재생이 제한적이며, 이로 인해 유모세포의 소실은 감각신경성 난청의 주요 원인이 된다(Choi, Abitbol, and Cheng 2024). 또한 유모세포의 소실은 비가역적으로 진행되어 영구적인 청력 저하를 초래하며, 이는 현재까지도 난청의 근본적인 치료가 어려운 주요 원인으로 작용한다.

노화, 과도한 소음 노출, 그리고 cisplatin, aminoglycoside antibiotics와 같은 이독성 물질은 난청을 유발하는 주요 위험 요인으로 알려져 있으며, 이들이 유도하는 난청은 공통적으로 와우 내 활성산소종의 과도한 생성과 항산화 방어체계의 불균형을 특징으로 한다(Fujimoto and Yamasoba 2014;Henderson et al. 2006;Wang et al. 2023;Wu, Sha, and Schacht 2002). 특히 와우 유모세포는 높은 산소 소비율과 미토콘드리아 의존적 에너지 대사 특성을 가지기 때문에 활성산소종 축적에 특히 취약하며, 과도한 활성산소종은 lipid peroxidation, protein oxidation 및 DNA damage를 유도하여 세포 기능 장애를 초래한다(Fujimoto and Yamasoba 2014;Fetoni et al. 2019). 또한 활성산소종은 미토콘드리아 기능 이상을 악화시켜 추가적인 활성산소종 생성을 유도하는 악순환을 형성하고, 이는 내인성 세포사멸 신호전달 경로를 활성화하여 유모세포 사멸을 촉진한다(Someya and Prolla 2010). 더 나아가, 활성산소종은 세포 내 신호전달 조절자로 작용하여 NF-κB 및 MAPK signaling pathway를 활성화시키고, 이에 따른 염증 반응을 유도하며(Pisani et al. 2026), 이러한 염증 반응은 다시 활성산소종 생성을 증폭시켜 와우의 퇴행성 손상을 가속화하는 것으로 보고되어 있다(Fujimoto and Yamasoba 2014). 따라서 산화 스트레스의 억제와 이에 따른 세포 손상 및 염증 반응의 조절은 소음성 난청(noise-induced hearing loss, NIHL), 노인성 난청(presbycusis), 그리고 이독성 난청의 예방 및 치료를 위한 중요한 전략으로 제시되고 있다. 특히 NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)는 세포 내 대표적인 항산화 전사인자로서 HO-1(heme oxygenase-1)을 비롯한 다양한 항산화 및 세포보호 유전자의 발현을 조절한다. NRF2/HO-1 경로의 활성화는 산화 스트레스로 유도되는 와우 손상을 완화하고 유모세포를 보호하는 것으로 보고되어, 난청 예방 및 치료를 위한 중요한 표적으로 주목받고 있다(Fetoni et al. 2015;Zhang et al. 2020).

지충이(Sargassum thunbergii (Mertens ex Roth) Kuntze)는 갈조류에 속하는 해조류로, 동아시아 연안에 널리 분포하며 전통적으로 식용 및 약용 자원으로 활용되어 왔다. S. thunbergii는 polyphenols, 특히 phlorotannins, quinones, 그리고 fucoidan을 포함한 다양한 polysaccharides 등 풍부한 생리활성 성분을 함유하고 있는 것으로 보고되어 있다(Jin et al. 2017;Luo, Wang, and Nie 2019). 이러한 갈조류 유래 phlorotannins은 phloroglucinol 기반의 phenolic compounds로서 항산화 및 항염증 활성을 나타내며, fucoidan과 같은 황산화 다당류 역시 면역 조절 및 항염증 효과를 포함한 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Khan et al. 2022;Giriwono et al. 2019).

또한 해조류 유래 polyphenolic compounds 및 polysaccharides는 활성산소종 제거 활성을 통해 산화적 스트레스를 억제하고, NF-κB 및 MAPK signaling pathway를 조절하여 염증 반응과 세포사멸을 완화하는 데 기여하는 것으로 알려져 있다(Khan et al. 2022;Besednova et al. 2022). 특히 S. thunbergii 유래 polysaccharide는 항산화 및 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Jin et al. 2017). 이러한 성분적 특성은 S. thunbergii가 산화적 스트레스 기반의 조직 손상, 특히 와우 유모세포와 같은 산화 스트레스 취약 세포에서 보호 효과를 나타낼 수 있는 잠재적 가능성을 시사한다. 그러나 청각계 세포를 대상으로 한 S. thunbergii의 보호 효과는 아직 충분히 규명되어지 않았다.

따라서 본 연구에서는 마우스 코르티 기관(Organ of Corti)에서 유래된 유모세포와 유사한 특성을 갖는 UB/OC-1 세포주를 이용하여, 산화적 스트레스에 의해 유도되는 세포 손상에 대한 지충이 추출물의 보호 효과를 평가하고자 하였다. 이를 위해 세포 생존율, 활성산소종 생성, 그리고 항산화 관련 지표를 분석하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 소재 준비

본 연구에서 사용된 Sargassum thunbergii (Mertens ex Roth) Kuntze(지충이)는 제주 연안에서 채집된 시료를 원료로 하여 제조된 추출물을 제공받아 사용하였다. S. thunbergii (ST) 추출물 제조는 (Kang et al. 2019)의 방법에 따라 수행되었다. 간략히, 채집된 시료는 흐르는 담수로 수차례 세척하여 염분 및 이물질을 제거한 뒤, 건조하여 분쇄함으로써 분말 형태로 제조하였다. 건조 분말 50 g에 증류수 2 L를 첨가하여 추출하였으며, 추출 방법에 따라 네 가지 조건으로 구분하였다. 증류수 추출물(STW), Celluclast 처리 추출물(STC), Termamyl 처리 추출물(STT), Ultraflo 처리 추출물(STU)로 각각 명명하였다. STW는 건조 분말에 증류수를 첨가한 후 상온에서 24시간 교반하여 제조하였다. 효소 가수분해 추출에는 Celluclast^® 1.5 L, Termamyl^® 120 L Type L 및 Ultraflo^® L (Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)을 사용하였다. 각 효소는 원물 중량 대비 1% (w/w)의 농도로 첨가하였다. 효소 반응은 각각의 최적 조건에서 수행하였으며, Celluclast 처리는 pH 4.5, 50°C에서, Termamyl 처리는 pH 6.0, 60°C에서, Ultraflo 처리는 pH 7.0, 60°C에서 각각 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 효소 활성을 억제하기 위하여 100°C에서 10분간 열처리하여 효소를 불활성화하였다. 이후 반응액은 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, Whatman filter paper (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 여과하였다. 여과액은 동결건조(freeze-drying)를 통해 분말 형태로 제조하였다. 각 추출물의 제조 방법 및 추출 수율은 STW는 19.8±1.70%, STC는 20.0±0.56%, STT는 28.3±0.14%, 그리고 STU는 25.1±0.14%이다(Kang et al. 2019). 제조된 각각의 추출물은 후속 실험에 사용하기 전까지 영하 20도에서 보관하였다. 세포 실험을 위해 각 추출물은 멸균 증류수에 용해하여 stock solution으로 제조하였으며, 사용 직전에 배지로 희석하여 처리하였다.

2. 세포배양

마우스 코르티 기관 유래 세포주 UB-OC1 (XIMBIO, CVCL-9636)은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 세포는 interferon-γ (IFN-γ, 50 U/mL)가 포함된 조건에서 33°C, 5% CO₂ 환경에서 8일간 증식시켰다. 이후 IFN-γ가 제거된 분화 배지에서 8-14일간 배양하여 분화를 유도하였다.

3. 세포 생존율 측정

세포 생존율을 MTT assay를 통해 측정되었다. UB-OC1 세포를 96-well plate에 3×10³ cells/well로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다.

세포 독성 평가는 다양한 농도의 ST 추출물(0-1000 µg/mL)을 단독 처리하여 수행하였다. 산화스트레스 조건에서의 세포 보호 효과를 평가하기 위해, 세포에 ST 추출물을 15시간 전처리한 후 H₂O₂ (700 µM)를 추가로 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 각 처리 후 MTT 용액을 각 well당 10 µL씩 처리하여 3시간 반응시킨 뒤, 배지를 제거하고 생성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 150 µL에 용해시켰다. 이후 실온에서 30분 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. ROS 측정

세포 내 활성산소종(ROS) 수준 측정을 위해 DCFDA assay와 CellROX Green assay를 수행하였다. DCFDA assay를 위해, UB-OC1 세포를 96-well plate에 2×10⁴ cells/well로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 세포를 PBS 세척한 후 CM-H₂DCFDA (C6827; Invitrogen)를 처리하여 37°C에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBS 세척 후, phenol red-free 배지에서 다양한 농도의 ST 추출물(0-100 µg/mL)과 H₂O₂ (700 µM)를 처리하고 37°C에서 60분 동안 반응시켰다. ROS 생성은 microplate reader를 이용하여 형광 강도(485/530 nm)를 측정하였다.

CellROX Green assay의 경우, 12-well plate에 UB-OC1 세포를 1×10⁴ cells/well로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후 ST 추출물(150 µg/mL)과 H₂O₂ (700 µM)를 처리하였다. 24시간 배양 후 CellROX Green reagents (C10444; Invitrogen)를 처리하여 37°C에서 30분 동안 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 세포는 confocal microscopy (FV3000; Olympus)를 이용하여 관찰하고, 이미지 분석을 수행하였다.

5. 면역세포화학염색(Immunocytochemistry)

UB-OC1 세포를 12-well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후 ST 추출물(150, 200 µg/mL)과 H₂O₂ (700 µM)를 처리하였다. 면역세포화학염색을 위해, 세포를 PBS로 세척한 후 4% paraformaldehyde로 고정하고, PBS-T (0.3% Triton X-100)로 투과화하였다. 이후 5% normal serum을 이용하여 실온에서 1시간 동안 blocking한 후, 1차 항체 anti-NRF2 (12721S; Cell Signaling Technology)를 포함한 blocking 용액에서 4°C, overnight 반응시켰다. 이후 PBS 세척 후, Alexa Fluor-conjugated 2차 항체를 포함한 blocking 용액에서 실온, 1시간 반응시켰다. 마지막으로 DAPI가 포함된 mounting medium을 사용하여 핵을 염색하고, confocal microscope를 이용하여 이미지를 분석하였다.

6. Quantitative real-time PCR

UB-OC1 세포로부터 total RNA를 NucleoSpin RNA Plus (MACHEREY-NAGEL)를 사용하여 추출하였다. 이후 1 µg의 RNA를 사용하여 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (FSQ-201; Toyobo)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 SYBR Green real-time PCR Master Mix (QPK-201; Toyobo)를 사용하여 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System에서 증폭 및 분석하였다.

사용된 primer 서열은 다음과 같다: NRF2 (forward: CAGCATAGAGCAGGACATGGAG, reverse: GAACAGCGGTAGTATCAGCCAG), Keap1 (forward: TCGAAGGCATCCACCCTAAG, reverse: CTCGAACCACGCTGTCAATCT), HO-1 (forward: CACTCTGGAGATGACACCTGAG, reverse: GTGTTCCTCTGTCAGCATCACC), β-actin (forward: GGCTGTATTCCCCTCCATCG, reverse: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT).

mRNA 발현 수준은 β-actin을 내재적 대조군으로 하여 정규화하였으며, 상대적 발현량은 2^-ΔΔCt 방법을 이용하여 분석하였다.

7. 통계 처리

모든 데이터는 GraphPad Prism 10 software를 사용하여 분석하였고, 평균±표준오차로 나타내었다. 모든 결과에서 one-way 분산 분석을 수행한 후 Tukey’s 다중비교검정을 통해 그룹 간 유의성을 평가하였다. 통계적 유의성은 vehicle control군 대비 *p<0.05, **p<0.01, 그리고 H₂O₂ 처리군 대비 #p<0.05, ##p<0.01로 정의하였다.

III. 결과 및 고찰

1. ST 추출물의 UB-OC1 세포 독성 평가

UB-OC1 세포에서 ST 추출물의 세포 독성을 평가하기 위해 다양한 농도(10-1000 µg/mL)에서 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 STW 또는 STC 처리군에서는 10, 20 µg/mL의 저농도에서 세포 생존율의 유의미한 감소는 관찰되지 않았으며, 대조군 대비 경미한 증가 경향이 나타났다<Figure 1A, B>. 그러나 150 µg/mL 이상의 고농도에서는 세포 생존율이 유의적으로 감소하여 두 추출물 모두에서 농도 의존적인 세포 독성이 나타났다. 반면, STT 또는 STU 처리군에서는 저농도부터 이미 세포 생존율이 유의적으로 감소하였으며, 농도가 증가함에 따라 독성이 더욱 뚜렷하게 나타났다<Figure 1C, D>. 이러한 차이는 분획 과정에서 사용된 효소의 기질 특이성에 따라 추출 성분의 조성이 달라진 데 기인할 가능성이 있다. Celluclast 처리에 의해 제조된 STC는 STW와 유사하게 낮은 세포 독성을 나타낸 반면, Termamyl 및 Ultraflo 처리 분획에서는 상대적으로 높은 세포 독성이 관찰되었다. 해조류 유래 polysaccharide는 효소 가수분해 과정에서 분자량 및 구조적 특성이 변화할 수 있으며, 이러한 변화는 항산화 활성뿐 아니라 세포 독성에도 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Mabate and Pletschke 2024). 따라서 추출 방법에 따른 생리활성 성분의 구조적 변화가 세포 독성 차이에 기여했을 가능성이 있다.

2. ST 추출물의 H₂O₂ 유도 산화 스트레스에 대한 세포 보호 효과

산화 스트레스 조건에서 ST 추출물의 세포 보호 효과를 평가하기 위해 UB-OC1 세포에 H₂O₂를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 후 각 ST 추출물을 처리하였다. H₂O₂ 단독 처리군에서는 세포 생존율이 유의미하게 감소하였으며, 이는 산화 스트레스에 의한 세포 손상 및 사멸이 유도되었음을 보여준다<Figure 2>. STW 처리군에서는 독성이 관찰되지 않는 농도 범위에서 H₂O₂에 의해 감소된 세포 생존율이 농도 의존적으로 회복되는 경향이 나타났으며, 이는 STW가 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 효과를 가지는 것을 시사한다<Figure 2A>. STC 처리군에서는 전반적으로 제한적인 보호 효과가 나타났으며, 25 µg/mL에서만 유의적인 세포 생존율 회복이 확인되었다<Figure 2B>.

반면, STT 처리군에서는 세포 독성이 관찰된 10 µg/mL보다 낮은 1 µg/mL의 저농도에서만 부분적인 보호 효과가 관찰되었고, 농도가 증가함에 따라 해당 효과는 유지되지 않는 결과를 보였다<Figure 2C>. STT 처리군에서는 세포 독성이 나타나는 농도(10-50 µg/mL)에서 산화 스트레스에 의해 감소된 세포 생존율이 추가적으로 감소하는 경향을 보였으며, 1 및 5 µg/mL의 낮은 농도에서도 보호 효과가 나타나지 않았다<Figure 2D>.

종합적으로, ST 추출물 중 STW는 비독성 농도 범위에서 가장 뚜렷한 세포 보호 효과를 나타냈으며, STC는 제한적인 효과를 보였고, STT와 STU는 상대적으로 높은 세포 독성으로 인해 보호 효과가 관찰되지 않았다. 갈조류 유래 phlorotannins은 강력한 활성산소종 제거 활성과 항염증 활성을 나타내며(Giriwono et al. 2019), fucoidan 역시 산화 스트레스에 의한 세포 손상을 완화하는 것으로 보고되어 있다(Jin et al. 2017). 따라서 본 연구에서 관찰된 STW 추출물의 세포 보호 효과는 이러한 수용성 생리활성 성분들과 관련된 가능성이 있다. 다만, 본 연구에서는 개별 성분의 함량 및 조성을 직접 분석하지 않았으므로, 이러한 효과에 기여한 구체적인 성분을 확인하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.

3. ST 추출물의 활성산소종 생성 억제 효과

ST 추출물이 산화 스트레스에 의한 활성산소종 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해, UB-OC1 세포에 H₂O₂를 처리한 후 세포 내 활성산소종 수준을 DCFDA 염색을 통해 측정하였다. H₂O₂ 처리군에서는 대조군에 비해 활성산소종 수준이 유의적으로 증가하여 산화 스트레스의 효과적인 유도가 확인되었다. STW과 STC 추출물 모두에서 H₂O₂ 처리에 의해 증가된 활성산소종 수준이 농도 의존적으로 감소되는 경향이 나타났으며, 고농도에서 뚜렷한 감소 효과가 확인되었다<Figure 3A, B>.

DCFDA assay가 H₂O₂ 처리 후 단기간 내 유도되는 초기 활성산소종 생성을 정량적으로 평가하는 반면, CellROX 염색은 장시간 산화 스트레스 조건에서의 세포 내 활성산소종 축적을 시각적으로 확인할 수 있다. 이에 따라 24시간 동안 H₂O₂와 ST 추출물을 처리한 후 CellROX 염색을 수행한 결과, H₂O₂ 처리에 의해 증가된 활성산소종 수준이 STW 또는 STC 처리군에서 감소하는 것으로 나타났다<Figure 3C>. 이러한 결과는 STW 및 STC 추출물이 급성 및 지속적 산화 스트레스 조건 모두에서 활성산소종 생성을 효과적으로 억제함을 보여준다. 세포 내 과도하게 축적된 활성산소종은 단순한 산화적 손상을 유발하는 것을 넘어 NF-κB 및 MAPK signaling pathway를 활성화하여 염증 반응과 세포 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Liu et al. 2020;Han et al. 2022). 따라서 STW 및 STC에 의한 활성산소종 감소는 산화 스트레스에 의해 유도되는 세포 내 downstream signaling cascade를 억제함으로써 세포 손상을 완화하는 데 기여했을 가능성이 있다.

4. ST 추출물의 NRF2 signaling pathway 활성화 효과

ST 추출물의 활성산소종 억제 효과의 하위 기전을 확인하기 위해 UB-OC1 세포에 H₂O₂ 및 ST 추출물을 처리한 후 NRF2 signaling pathway의 변화를 분석하였다. 형광 이미지 분석 결과, H₂O₂ 처리군에서는 대조군에 비해 NRF2 형광 신호가 증가하며 핵 내로의 이동이 부분적으로 관찰되었다. 정량 분석에서도 NRF2 형광 강도가 경미하게 증가된 경향이 확인되었다<Figure 4A>. 이러한 NRF2 단백질의 제한적인 증가는 산화 스트레스에 대응하기 위한 세포의 내인성 보상 반응을 반영하는 것으로 보이며, 유사한 결과가 기존 연구에서도 보고된 바 있다(Mercado et al. 2011;Wang et al. 2021).

H₂O₂ 단독 처리군에서 관찰된 NRF2의 제한적인 변화와 달리, STW 또는 STC 처리군에서는 NRF2 형광 신호가 더욱 뚜렷하게 증가하고, 핵 내 축적이 증가하는 양상이 확인되었다. 특히 STW와 STC 모두에서 농도 의존적으로 NRF2 형광 강도가 증가하는 경향이 나타났으며, 정량 분석에서도 유의미하게 증가하는 것이 확인되었다<Figure 4A>. 이러한 결과는 STW 및 STC가 H₂O₂에 의해 유도된 제한적인 NRF2 활성화를 추가적으로 증강시킴으로써 보다 적극적인 항산화 방어 기전의 강화 역할을 할 가능성을 시사한다.

다음으로, qPCR을 통해 NRF2 signaling pathway 관련 유전자 발현 변화를 확인하였다<Figure 4B-D>. Nrf2 mRNA 발현은 H₂O₂ 처리군에서 대조군 대비 소폭 증가하는 경향이 나타났으며, STW 및 STC 처리에 따라 추가적인 증가가 관찰되었다<Figure 4B>. 이러한 결과는 통계적으로 유의미하지는 않았지만, 단백질 핵 내 이동 경향과 유사한 양상으로 나타난 것을 확인하였다<Figure 4A, B>. NRF2 signaling pathway의 대표적인 하위 발현 유전자인 HO-1 mRNA의 발현도 마찬가지로 H₂O₂ 처리군에서 증가하는 경향을 보였으며, STW 및 STC 처리군에서 더욱 뚜렷하게 농도 의존적으로 증가하였다. 이는 NRF2 활성화 증가 및 signaling pathway 활성화가 HO-1의 전사 수준에서 반영되었음을 확인할 수 있었다<Figure 4C>. NRF2의 음성 조절자인 Keap1의 발현은 H₂O₂ 처리에 의해 소폭 증가하는 경향을 보였으며, 이는 산화 스트레스에 대응하여 활성화된 NRF2 signaling에 대한 음성 피드백 반응으로 해석된다<Figure 4D>. NRF2 signaling pathway는 산화 스트레스에 대한 대표적인 세포 방어 기전으로 알려져 있으며, 내이 유모세포의 생존과 청각 기능 유지에도 중요한 역할을 수행한다(Kensler, Wakabayashi, and Biswal 2007). 실제로 NRF2 결손 마우스에서는 소음 노출에 의한 청력 손상이 더욱 악화되고(Honkura et al. 2016), 연령 증가에 따른 청력 저하 역시 가속화되는 것으로 보고되어 있다(Hoshino et al. 2011). 본 연구에서 관찰된 NRF2 활성화와 HO-1 발현 증가는 STW 및 STC가 단순히 활성산소종 억제 효과를 보일 뿐 아니라 내인성 항산화 방어 시스템을 활성화함으로써 세포 보호 효과를 나타낼 가능성을 시사한다. 특히 Nrf2 mRNA 변화가 비교적 제한적이었던 반면, NRF2 단백질 활성화와 HO-1 발현 증가는 NRF2 활성화가 전사 수준의 증가보다는 keap1으로부터의 해리, 단백질 안정화 및 핵 내 이동과 같은 전사 후 조절 기전에 의해 이루어졌을 가능성을 뒷받침한다.

IV. 요약 및 결론

본 연구에서는 갈조류 ST 추출물의 와우 유모세포 유사 세포인 UB-OC1 세포에서의 세포 보호 및 항산화 효과를 평가하였다. ST 분획 중 STW와 STC는 비독성 농도 범위에서 H₂O₂에 의해 유도된 세포 손상을 효과적으로 완화하였으며, 세포 내 활성산소종 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 STW와 STC는 NRF2의 핵 내 활성화를 증가시키는 경향이 관찰되었고, HO-1 발현을 촉진시키는 반면 keap1 발현을 감소시켰다. 이는 Keap1-NRF2-HO-1 signaling pathway 활성화와 연관된 세포 내 항산화 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 STW 및 STC가 산화 스트레스에 의한 와우 유모세포 손상을 완화할 수 있는 잠재적 기능성 소재임을 시사한다. 다만, 본 연구는 in vitro 세포 모델을 기반으로 수행되었으므로, 향후 동물 모델을 이용한 청각 보호 효과 검증과 활성 성분 규명을 위한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.