I. 서 론
Ferroptosis는 심부전, 동맥경화 등과 같은 심혈관 질환의 발병에 관여하는 것으로, 반응성 산소종(reactive oxidative species, ROS)의 발생과 철 의존적인 지질 과산화물(lipid peroxidation)축적, 그리고 미토콘드리아 수축이 주요한 특징 으로 나타난다(Otasevic et al. 2021). 또한, ferroptosis는 시 스틴/글루타메이트 항포터 시스템(xCT-시스템) 기능 장애, 글 루타치온(glutathione, GSH) 고갈, 글루타치온 의존 항산화 효소인 글루타치온 퍼옥시다제 4 (glutathione peroxidase 4, GPX4) 비활성화에 의해 유발된다(Yang & Stockwell 2015). 이 중 xCT 시스템은 GSH의 합성에 필요한 세포내 시스테 인을 유도하여, 세포내 GSH 농도를 감소시키고, 세포 산화 환원 항상성과 항산화 능력의 불균형을 초래하여 세포막 손 상을 일으킨다(He et al. 2024b). 따라서 GPX4/GSH는 ferroptosis에서 필수적인 조절 시스템이라 할 수 있다.
혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells, VSMCs)는 혈관벽에서 주요한 세포를 구성하는 것으로 혈관의 구조적 안정성을 유지하고 혈압 조절에 중요한 역할을 한다. 혈관평 활근세포의 주요 역할은 외부 자극에 반응하여 수축과 확장 을 통해 혈액을 재분배하여 혈관의 부피와 혈압을 변화시키 는 것이다(Ji et al. 2023). 혈관평활근세포에서 ferroptosis는 심혈관 질환의 발병 시 혈관평활근세포의 손실에 기여하는 중요한 메커니즘으로 밝혀지고 있다(Grootaert et al. 2018;Wang et al. 2021). 최근, ferroptosis의 유도는 혈관평활근세 포 표현형 전환(phenotype switching)을 촉진하고 마우스에 서 내막과형성을 악화시킨다는 보고가 있었다(Zhang et al. 2022). 또한, ferroptosis의 억제제인 ferrostain-1 (Fer-1)가 혈관평활근세포의 ferroptosis를 억제하고 복부 대동맥류 형 성, 동맥경화를 완화시키는 효과가 있다고 보고되었다(You et al. 2023;He et al. 2024a). 그러므로 혈관평활근세포에서 ferroptosis의 억제는 혈관질환의 치료에 대한 새로운 접근방 법을 제공할 수 있을 것이다.
Chrysanthemum coronarium. L은 지중해 지역에 널리 분 포하는 식물로 한국, 중국, 등의 아시아 지역에서도 분포되 어 있는 식물로 특히 한국에서는 쑥갓이라는 이름으로 불리 고 있으며 채소이면서 약용, 관상용 식물이다. 쑥갓은 비타 민 A, C, K, 철분, 그리고 마그네슘 등의 다양한 비타민과 미네랄을 함유하고 있다. 쑥갓은 항산화, 항고콜레스테롤혈 증, 항고혈당 등의 생물학적 기능을 가지고 있다(Abd-Alla et al. 2013; Donia 2014;Kim et al. 2014). 또한, 쑥갓은 세 포에서 항염증 및 항증식 효능을 나타낸다고 알려져 있다 (Takenaka et al. 2000;Kim et al. 2014). 최근에 본 연구 진은 쑥갓이 골다공증에 의한 골 손실의 예방효과가 있다는 것을 보고하였다(Kim et al. 2020). 더불어, 쑥갓은 혈관평활 근세포에서 혈관 염증을 억제하는 효과가 있다는 것도 확인 보고하였다(Lee et al. 2023). 이를 근거로 하여, 본 연구에서 는 쑥갓추출물(CC)이 혈관평활근세포에서 ferroptosis의 억제 제로서 활용될 수 있는 근거를 마련하고자 erastin (Era)로 유발된 ferroptosis에 쑥갓추출물의 억제 효과 및 관련 조절 기전을 관찰하고자 하였다.
II. 연구 내용 및 방법
1. 소재 준비
건조된 쑥갓(1 kg)을 분쇄 한 후 50% 에탄올 10 L에 넣고 24시간 동안 두 번 추출 한 후 필터지를 활용하여 여과하고 회전 증발기로 증발시켰다. 이렇게 얻은 쑥갓 추출물은 -70 °C에서 동결건조 하였다. 쑥갓의 추출 수율은 8% (w/w)로 측정되었다. CC를 이용한 모든 실험은 기관, 국가 및 국제 지침과 법률에 따라서 수행하였다.
2. 세포 배양 및 세포 처리
쥐(rat)의 대동맥 흉부 평활근에서 유래한 A7r5를 ATCC (American Type Culture Collection, ATCC, Manasssas, VA, USA)에서 구입해서 실험을 진행하였다. 10% fetal bovine serum (ATCC, Manasssas, VA, USA), penicillin (100 U/mL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)과 streptomycin (100 μg/mL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 넣은 dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, ATCC, Manasssas, VA, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 그리고 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 수행하였다.
3. 세포 생존율(Cell viability)
세포 생존율은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan)을 이용하여 분석하였다. A7r5세포는 96 well plate (1×104 cells/well)에 분주하여 24 시간 배양하였다. 분주 된 세포에 ferroptosis 유도제인 Era (10 μM)와 농도별 CC (10, 25, 50 μg/mL)/ferroptosis 억제 제인 F er- 1 (5 μM)을 동시 처리하였다. 24시간 배양한 후 CCK-8 시약의 설명서를 따라 실험을 진행한 후 microplate reader (Spectra MAX 190; Molecular Devices, San Jose, CA, USA) 로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존 율은 대조군 대비 백분율로 나타내었다.
4. 지질 과산화(Lipid peroxidation)
A7r5 세포를 6 well plate (1×104 cells/well)에 분주하였다. 분주된 세포에 Era (10 μM)와 농도별 CC (10, 25, 50 μg/ mL)/ Fer-1 (5 μM)을 동시 처리하였다. 16시간동안 인큐베이 터에서 배양 한 후 C11-BODIPY581/591 (5 μM, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포내 지질 과산화를 측정하 고자 하였다. 형광 측정을 통해 값을 읽었으며, microplate readers (Molecular devices)를 사용하여 581/591 nm 파장에 서 측정하여 분석하였다.
5. Glutathion 측정
A7r5 세포(1×104 cells/well)를 96 well plate에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 분주 된 세포를 Era (10 μM)와 농 도별 CC (10, 25, 50 μg/mL)/ Fer-1 (5 μM)을 동시처리하 여 24시간 동안 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 GSH 검출 키트(DoGen Bio, Korea, Seoul)를 사용하여 412 nm 파장에서 microplate reader를 사용하여 GSH 수치를 측정하 였다.
6. 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscope)
A7r5 세포를 60mm 배양 접시에 분주하였다. 24시간 후 분주한 세포에 Era (10 μM)와 CC (50 μg/mL)을 동시 처리 한 후 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 세포에 2% 글루타르알데히드와 1% 사산화 오스뮴을 처리하여 고정하 였다. 그런 다음 세포 샘플을 초박형 섹션으로 자르고, 2% 우라닐 아세테이트로 염색, 탈수하여 매립한 후 구연산납으 로 다시 염색했다. 이미지는 투과 전자 현미경(HT7700, Hitachi, Ibaraki, Japan)을 통해 획득하였다.
7. 단백질 발현 측정(Western blot analysis)
A7r5세포는 6 well (1×105 cells/well)에 24시간 배양 후 세포를 Era (10 μM)와 농도별 CC (10, 25, 50 μg/mL)/ Fer-1 (5 μM)을 동시 처리하였다. 24시간 배양 후 PBS로 세 포를 세척 후, lysis buffer를 세포에 분주하여 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상만 분리하였다. 단백질 농도는 BCA kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질은 polyacrylamide gel에 전기영동하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 전이 시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유에 넣고, 상온에서 blocking 시킨 후, 1차 항체 glutathione peroxidase 4 (GPX4; ab125066, Abcam), xCT (ab175186, Abcam Cambridge, UK), β-actin antibody (Santacruz, Dallas, TX, USA)에 1:1000 희석한 후 4°C에 서 overnight 하였다. 다음으로 2차 항체를 반응시켰다. Specific band는 ECL solution (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Chemidoc XRS+ imaging system (Biorad, Hercules, CA, USA)를 통해 측정하였다.
8. 통계처리
모든 실험의 결과는 평균값±표준 오차 평균(mean±SD)으 로 표현하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Graph pad 9.0 program를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후 검정은 turkey test 를 적용하여 분석하였다. p<0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
III. 결과 및 고찰
1. 쑥갓 추출물의 세포 생존율 평가
쑥갓은 항염증, 항산화, 항콜레스테롤 등의 생물학적인 효 능을 가진 채소이며, 약용 생물로 알려져 있다. 본 연구진은 CC가 골건강에 효능이 있다고 보고하였다(Kim et al. 2020). 또한, CC이 신장손상모델에서 항염증효과가 있다는 것도 보 고하였다(Kim et al. 2023). 뿐만 아니라, 최근 CC이 혈관평 활근세포에서 항염증 효과가 있음도 밝혔다(Lee et al. 2023). 현재까지 많은 연구자들이 ferroptosis에 의한 혈관 기 능 저해를 억제함으로써 혈관질환의 치료제를 찾으려는 소 재 연구를 많이 진행하고 있지만, CC이 혈관을 이루는 주요 한 구성요인 중 하나인 혈관평활근세포에서 ferroptosis에 미 치는 영향에 대한 연구는 거의 진행되지 않았다. 따라서, 본 연구에서, CC이 Era에 의해 유도된 ferroptosis를 억제하는 효능과 관련 기전을 규명하고자 하였다.
먼저, CC가 혈관평활근세포에서 자체적으로 세포 독성을 나타나는지를 평가하기 위해 A7r5세포에 CC를 농도(10, 25, 50 μg/mL)에 따라 처리한 결과, 세포 생존율에서 NC (Normal control) 군과 비교했을 때 CC에서 유의성이 나타 나지 않았으며, CC의 농도에 따라서도 차이는 보이지 않았 다<Figure 1A>. Era을 처리 시 NC 군에 비해 세포 생존율 이 52%까지 감소하는 것을 관찰하였다(p<0.001). 그러나, Era와 CC를 동시 처리 시 유의하게 회복되는 것을 볼 수 있 었다(p<0.001). 또한, Era와 F er- 1를 동시 처리 시에도 유의 하게 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그러나 CC의 농도 에 따라서 세포의 생존율 차이는 나타나지 않았다<Figure 1B>. 다음으로, Era에 의해 유도된 세포 사멸이 CC에 의해 회복 시 변화하는 세포의 모양을 현미경으로 관찰하였다. <Figure 1C>에서 보는 것처럼 NC군에서 배열이 고르고, 길 쭉하고, 통통한 모양의 A7r5 세포를 관찰할 수 있었다. Era 군에서는 세포가 손상되어 바닥에 부착되어 있는 세포는 관 찰할 수 없었고, 사멸되어 모양이 없어지고 하얗게 둥근 모 양을 관찰할 수 있었다. 그러나, CC 50 mg/mL과 F er- 1을 같 이 처리한 군에서는 NC군에서 보이는 것처럼 세포들이 손 상되지 않고 바닥에 잘 붙어있는 것을 관찰할 수 있었다. 이 상의 결과로 보아 CC는 Era에 의해 손상된 세포의 생존율 을 증가시키는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
2. 쑥갓 추출물의 Era에 의해 손상된 미토콘드리아 형태 변화 분석
일반적으로 세포의 발전소로 알려진 미토콘드리아는 세포 에너지 생성에서 중요한 역할을 담당한다. 그러나, 최근 연 구들에 의하면 미토콘드리아는 단순한 에너지 생산자 이상 의 기능을 수행한다고 알려지고 있다. 칼슘 항상성 유지와 ROS 조절부터 세포 자멸사(autophagy) 조율과 조절에 이르 기까지 다양한 기능을 수행하고 있다고 보고되고 있다(Gao et al. 2019;Vercellino & Sazanov 2022). 이와 더불어, 최 근에는 ferroptosis에 의해 미토콘드리아의 형태학적 구조의 변화에 대한 다양한 논문이 제시되고 있다(Otasevic et al. 2021;Wang et al. 2023a). 즉, ferroptosis 유도제인 Era을 처리하면 미토콘드리아 막의 밀도 증가, 부피 감소, 미토콘 드리아 cristae 감소 또는 소멸, 미토콘드리아 외막의 파열을 동반한다고 알려져 있다(Zhao et al. 2020).
본 연구에서는 CC를 처리 시 Era에 의해 손상된 미토콘드 리아의 형태학적인 구조에 영향을 미치는지 확인하기 위해 투과전자현미경을 통해 평가해 보았다. 그 결과 Era을 처리 시 NC에 비해 미토콘드리아의 부피 감소, cristae가 감소, 밀 도가 증가하는 것을 볼 수 있었다. 그러나, CC를 같이 처리 시 Era의 의해 변화된 미토콘드리아의 형태의 변화가 NC처 럼 회복되어 있는 것을 확인 할 수 있었다<Figure 2>. 이상 의 결과로 CC는 Era에 의해 변화된 미토콘드리아의 구조를 회복시키는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
3. 쑥갓추출물의 Era에 의해 유도된 GSH와 지질 과산화(lipid peroxidation)의 회복 효능
Ferroptosis와 관련된 메커니즘은 복잡하지만, 아미노산, 철, 불포화지방산의 대사와 GSH 의 생합성 등과 같은 생물학적 과정들과 밀접한 관련이 있다. 이러한 다양한 대사와 관계가 있는 ferroptosis는 주로 과도한 ROS의 축적과 지질 과산화 생성의 특징을 가지고 있다(Hajj et al. 2024;He et al. 2024a). 즉, ferroptosis는 글루타치온을 기질로 사용하는 인 지질 과산화효소에 의해 유지되는 산화 환원량을 초과하는 ROS의 축적으로 발생되는 것이다(Hajj et al. 2024).
본 실험에서는 CC가 GSH 생성과 지질 과산화 축적에 영 향을 미치는지 확인하기 위해 GSH 검출 키트와 C11- BODIPY581/591를 활용하여 평가한 결과, 먼저 Era 처리 시 GSH가 유의하게 감소되는 것을 볼 수 있다(p<0.001). 그러 나, CC를 같이 투여 시 Era에 의해 감소된 값이 유의하게 다시 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(p<0.001). 또한, Fer-1 을 같이 처리 시에도 Era에 의해 감소한 GSH가 유의하게 증가(p<0.001)함을 확인하였으나, CC의 농도에 따라 유의한 차이가 나타나진 않았다<Figure 3A>. 다음으로, 지질 과산 화는 Era을 처리 시 NC에 비해 유의하게 증가함을 볼 수 있었다(p<0.001). 그러나, CC를 투여 시 Era에 의해 증가한 지질과산화가 농도에 의존적으로 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다(p<0.001). 또한, Fer-1을 같이 처리시에도 Era에 의해 증가한 지질 과산화가 유의하게 감소함을 관찰할 수 있었다 (p<0.001)<Figure 3B>. 이상의 결과로 보아 CC는 Era에 의 해 변화된 GSH와 지질 과산화를 회복시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
4. 쑥갓 추출물의 Era에 의해 감소한 xCT와 GPX4의 회복 효능
GPX4는 혈관세포에서 xCT를 통해 glutamate/cysteine의 세포의 이동을 통해 GSH의 생성을 유도하는 중요한 역할을 담당한다. GPX4/xCT의 기능이 비정상적으로 움직이게 되면 지질 과산화와 산화 스트레스 등을 유발하여 혈관벽의 손상 이나 염증 등이 유발되어 고혈압, 동맥경화등의 혈관질환을 일으킬 수 있다. 따라서, GPX4/xCT 신호전달기전의 조절은 혈관질환을 조절을 위한 하나의 열쇠로 작용할 수 있다(Jiang et al. 2021). GPX4의 상위에 있는 xCT와 GSH 생합성과 같이 보호 효과를 내는 조절 인자에 장애가 발생하면 ferroptosis 가 발생할 수 있다. 즉, GPX4는 GSH를 사용하여 세포 지 질 과산화수소를 제거, ferroptosis를 억제하는 것이다(Zhao et al. 2020). 그러나, 이러한 신호전달 기전의 균형이 무너지 면 혈관평활근세포에서 GSH 생성은 감소, ferroptosis, 비정 상적인 항산화 system 작동, 혈관평활근세포 표현형 변화 등 이 유발된다(Bai et al. 2020). 따라서, 우리는 다양한 유효성 분을 함유하고 있는 CC가 Era에 의해 유도된 ferroptosis을 억제하는 효과가 있는지 확인해 보기 위해 혈관평활근세포 에서 평가해 보았다. Era는 세포 안으로 들어오는 cystine을 차단함으로써 xCT의 발현을 억제하고 세포내 원형질막의 파 괴를 일으키는 ferroptosis를 유도한다. 이것은 GSH의 발현 을 감소시키고, ROS의 생성을 증가시키며 미토콘드리아의 기능상실을 통한 세포사멸을 유도하게 된다. 본 실험에서 CC 는 Era에 의해 유도된 xCT와 GPX4의 단백질 발현에 영향 을 미치는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 실시하여 평가한 결과, Era를 처리한 군에서는 NC에 비해 xCT와 GPX4의 단백질 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(p<0.001). 그 러나, CC를 같이 투여하였을 때 Era를 처리한 것에 비해 xCT와 GPX4의 단백질 발현은 증가하는 것을 관찰할 수 있 었다(p<0.001). 또한, Fer-1을 같이 처리 시에도 Era에 의해 감소한 이들의 단백질 발현이 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다(p<0.001). 그러나, CC의 농도에 의존적으로 유의한 차이가 나타나진 않았다<Figure 4>. Wang et al은 3,5-dicaffeoylquic acid (DQA)는 암세포에서 미토콘드리아의 기능 상실과 GPX4/xCT발현을 조절함으로써 ferroptosis을 억제하였다고 보고하였다(Wang et al. 2023b). 또한, chlorogenic acid는 지질과산화와 xCT/GPX4의 발현을 조절함으로써 ferroptosis 를 억제한다고 보고하다(Zhou 2020). 이러한 선행연구와 유 사하게, DQA나 chlorogenic acid와 같은 유효성분들을 함유 하고 있는 CC는 xCT/GPX4의 신호전달 기전을 통해서 ferroptosis의 억제 효과를 나타낼 것이라 사료된다.
채소, 약용식물, 또는 여기에서 유래된 플라보노이드가 포 함된 식품 등을 섭취하면 혈관질환의 진행을 지연시킬 수 있 다는 역학적 증거들이 증가 하고 있다(Kim et al. 2020). 이 에 따라 본 연구진은 채소이면서 약용식물로 섭취하고 있는 CC가 혈관평활근세포에서 ferroptosis를 억제하는 효과가 있 는지 확인 해보고자 하였다. 현재까지 많은 연구들에서 CC 및 CC유래 화합물들은 유익한 효과가 있다는 것을 나타내 고 있다. 본 연구진은 선행 연구들에서 쑥갓 추출물에 caffeic acid, chlorogenic acid, rutin, cynarin, 3,4-dicaffeolquinic acid, 그리고 3,5-caffeoyl-4-succinoyl quinic acid등의 성분 이 함유되어 있음을 보고 하였다(Lee et al. 2023;Kim et al. 2023). Rutin은 ferroptosis에 의해 유도된 oxidative stress를 억제한다고 알려졌다(Wu et al. 2023). 또한, rutin은 폐동맥고혈압 동물모델에서 ferroptosis를 억제함으로써 보호 효과를 나타낸다는 보고도 있다(Che et al. 2024). 더불어, caffeic acid는 산화스트레스와 ferroptosis를 억제한다고 보고 되었으며(Li et al. 2024), chlorogenic acid는 심장세포에서 ferroptosis를 억제함으로써 심부전을 완화시키는 효능이 있 다고 보고 되었다(Huang et al. 2024.). 게다가, DQA는 oxidative stress을 완화시키는 효과가 있다고 알려져 있다 (Lim et al. 2020). 따라서, 우리는 여러 생리활성 화합물을 포함한 CC가 혈관평활근세포에서 Era에 의해 유도된 ferroptosis를 억제하는 효과를 나타낼 것이라고 가정하였고, 그 결과 CC는 Era에 의해 유도된 지질 과산화, GSH 생성 감소, 미토콘드리아의 형태학적인 구조 변화를 개선시킴으로 ferroptosis를 억제하는 효과가 있음을 나타낼 수 있었다. 그 러므로, CC는 혈관질환을 예방하는 효과가 있을 것으로 사 료되며, 기능성 식품 보충제로서의 개발 가능성을 제안할 수 있을 것이다.
IV. 요약 및 결론
본 연구에서는 쑥갓추출물에서의 ferroptosis 억제 효과를 확인하고자 하였다. 혈관평활근세포에 CC와 ferroptosis 유도 물질인 Era를 동시에 처리 후 ferroptosis 관련 마커들의 변 화를 분석하였다. 그 결과 CC는 세포 생존율을 회복시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, CC는 Era에 의해 유 도된 지질 과산화, GSH 생성 감소, 미토콘드리아의 형태학 적인 구조 변화를 개선시키는 것으로 나타났다. 게다가, CC 는 Era에 의해 감소한 GPX4/xCT 단백질 발현을 회복시키 는 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보아 CC는 동맥경화 등의 혈관질환에 예방효과가 있을 것 으로 사료되며, 기능성 소재 개발을 위한 기초자료로서 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.