I. 서 론
최종당화산물(Advanced Glycation Endproduct, AGEs)은 환원당과 단백질 또는 지질 간의 비효소적 반응에 의해 생 성되며, 다양한 대사 질환의 원인으로 주목받고 있다(Sergi et al. 2021). 당과 아미노산은 비효소적인 반응인 마이야르 반응이 일어나 쉬프염기(Schiff base)를 생성한 후 재배열 되 어 아마도리(amadori)형의 초기 당화산물(early glycation endproducts)을 생성하는데 이 반응은 가역적으로 일어난다. 그러나 고혈당이 지속되면 아마도리형 초기 당화산물이 분 해되지 않고 재배열 되고 콜라겐(collagen)과 같은 단백질과 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인, 즉 분해되지 않은 최 종당화산물(late glycation product)이 생성된다(Bucala et al. 1995). AGEs는 주로 생체 내에서 발생하는 생물학적 과정을 통해 형성되고 축적되지만, 조리된 음식 섭취와 흡연을 통해 서도 체내에 축적될 수 있다(Botros et al. 2017). 체내에서 AGEs의 생성은 매우 천천히 일어나지만 동물성 지방 및 단 백질이 풍부한 식품을 고온에서 조리할 경우 AGEs가 많이 생성된다고 알려져 있다(Goldberg et al. 2004). 이러한 AGEs는 AGE 수용체 (RAGE) 단백질과 상호작용하여 산화 스트레스, 염증, 세포자멸사를 유도하여 인체에 영향을 미치 게 된다.
글리옥살(glyoxal-lysine dimers, GOLD)과 메틸글리옥살 (methylglyoxal-lysine, MOLD)과 같은 디카보닐(di-carbonyl) 화합물은 최종당화산물의 중간 산물로, 다양한 AGEs를 생 성하는 것으로 알려져 있다. 이들 화합물에는 글리옥살 또는 메틸글리옥살과 라이신 잔기가 교차 결합하여 생성되는 ε- (carboxymethyl)-lysine (CML)과 N Nε-(carboxyethyl)- lysine (CEL), 그리고 메틸글리옥살과 아르기닌이 결합하여 Nδ-(5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-L-ornithine (MG-H1)이 포 함된다(Lee et al. 2021a, Lee et al. 2021b). 대표적인 디카 보닐 유래 AGEs에 대한 다양한 연구가 그들의 생체 내 영 향에 대해 진행되었다. 그러나 두 개의 라이신이 각각 글리 옥살 또는 메틸글리옥살과 반응하여 추가로 생성되는 최종 당화산물인 글리옥살-라이신 이합체(glyoxal-lysine dimers, GOLD)와 메틸글리옥살-라이신 이합체(methylglyoxal-lysine, MOLD)에 대해서는 제한된 연구만 이루어졌다. GOLD와 MOLD는 초기의 bis-lysyl diimine 중간체가 두 번째 글리옥 살 분자와 Cannizzaro형 반응을 통해 탈수 후 최종적으로 이 미다졸륨 이합체(imidazolium dimer)를 형성하는 방식으로 생성된다(Vistoli et al. 2013). Takeuchi 등은 이러한 AGEs 를 비독성 AGEs로 분류하며, 알데하이드 및 카보닐 화합물 을 포획하고 해독하는 생물학적 방어 기전의 일환으로 생성 된다고 제안하였다(Takeuchi 2020). 그러나 많은 보고서에서 는 이러한 AGEs의 독성이 다양한 질병을 유발할 수 있다고 언급하고 있다. 총 혈장 CML 및 CEL 수치는 제1형 당뇨병 환자에서 증가하였으며, 이는 내피 세포 기능 장애와 만성 신장 질환의 지표와 관련이 있었다(Rabbani & Thornalley 2018). 또한, MG-H1 형성의 증가는 만성 신장 질환 발병의 중요한 요소로 확인되었다(Ito et al. 2017). 따라서 AGEs의 역할을 규명하는 것은 대사 질환의 예방 및 억제에 도움이 될 수 있다. Frye 등은 인간의 수정체 단백질에 GOLD와 MOLD가 높은 농도로 축적된다고 보고하였으나, 이러한 AGEs의 기능적 역할에 대해서는 연구가 부족하다(Frye et al. 1998). 더 나아가, GOLD와 MOLD가 신장에 미치는 영 향에 대한 연구도 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 GOLD와 MOLD가 신장 세포독성에 미치는 영향을 조사하 였다
II. 연구 내용 및 방법
1. 재료 및 방법
본 실험에 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin-streptomycin (PS), fetal bovine serum (FBS) 및 phosphage burffer saline (PBS)은 Gibco (Rockville, MD, USA)에서 구매하였다. 또한 Dimethylsulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Bovine serum albumin (BSA), Griess reagent, Lipopolysaccharides (LPS) 및 다른 모든 시약들은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA), 항체는 Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하 였다. GOLD와 MOLD는 Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)에서 구입하였다. 2',7'-Dichlorofluorescin Diacetate (DCF-DA)와 thiazolyl blue tetrazolium bromide는 Sigma (USA St. Louis, MO)에서 구입하였고, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), Receptor for advanced glycation end-products (RAGE), Glyoxalase 1 (Glo1), Superoxide dismutase 2 (SOD2), Catalase, Beclin1, Protein kinase B (AKT), Phosphorylate AKT (p-AKT), Mechanistic target of rapamycin (mTOR), Phosphorylated mechanistic target of rapamycin (p-mTOR), B-cell lymphoma 2 (BCL2), BCL2-associated X protein (BAX), Extracellular signal-regulated kinase (ERK), Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), p38 Mitogen-activated protein kinase (p38), Phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase (p-p38), c-Jun N-terminal kinase (JNK) 및 Phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (USA, Danvers, MA)에 서 구입하였다. Interleukin-1 beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) 및 Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α)에 대한 항 체는 Abcam (UK, Cambridge)에서, Toll-like receptor 4 (TLR4) 및 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (USA, Santa Cruz, CA)에서, 2차 항체는 Thermo Fisher Scientific (USA, Waltham, MA)에서 구입하였다.
2. 세포배양 및 세포독성 측정
SV40 MES 13 세포는 American Type Culture Collection (USA, Rockville, MD)에서 구입하였다. 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium과 Ham’s F12 배지를 3:1 비율 로 혼합하고 5% 태아 Fetal Bovine Serum (FBS), 14 mM HEPES, 1% penicillin/streptomycin 용액을 첨가하여 배양하 였다. MOLD 또는 GOLD를 SV40 MES13 신장세포에 24 시간 처리한 후, 세포 생존율을 측정하기 위해 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 수행하였다. MTT 시약 0.1 mg/mL을 첨가하여 3시 간 동안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양한 후 동량의 DMSO 에 녹여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%) 은 다음과 같은 식을 사용하여 나타내었다.
3. 세포 내 Reactive Oxygen Species (ROS) 측정
MOLD (1 mM) 또는 GOLD (1mM)로 유도된 산화 스트 레스는 DCF-DA염색을 수행하여 측정하였다. 세포는 96-well 및 24-well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 MOLD 또는 GOLD를 처리하고 37°C에서 90분 동안 배양 하였다. 이후 DCF-DA (20 μM)를 well에 첨가하고 37°C에 서 추가로 20분 동안 배양하였다. 그 후, microplate reader devide (Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 형광도 를 측정하였으며, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 촬영하였다.
4. Western blot을 통한 항산화 단백질 발현분석
세포의 단백질은 PRO-PREPTM (South Korea, iNtRON Biotechnology)을 사용하여 추출하였다. 단백질은 8, 10, 또 는 12% 젤을 사용한 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한 후 polyvinylidene fluoride (PVDF) 멤브레인으로 이전하였다. 비특이적 결합 부 위제거를 위해 blocking buffer (Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20 and 5% nonfat dry milk)를 이용하여 1 시간 동안 반응시킨 후, 1차 항체를 이용하여 4°C에서 하룻 동안 반응시켰다. Membrane을 세척한 후 2차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 단백질 밴드는 ChemiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 검출하였다. 단백 질 정량은 Image Lab 통계 소프트웨어(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.
5. 자가포식(Autophagy) 측정
MOLD (1 mM)와 GOLD (1 mM)로 유도된 자가포식은 MuseTM Cell Analyzer와 MuseTM Autophagy LC3-Antibody 기반 키트(Merck Millipore, Australia. Sydney)를 사용하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)에서 37°C에서 2시간 동안 배양된 세포를 사용하였다. 자가포식 유도는 실험군과 대조군의 형광 비율 로 결정하였다. 또한 자가포식과 관련된 단백질 발현의 조절 을 확인하기 위하여 AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, Beclin1, LC3/AB (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 측정하여 자가포식 관련 시그널링에 관여하는 지 확인하였다.
6. 세포사멸(Apoptosis) 분석
세포사멸의 중요한 바이오마커 중 하나인 Caspase-9과 BCL2/BAX, Cytochrome C 발현을 확인하기 위하여 western blot 분석을 실시하였다. 사용된 항체로는 Caspase-9, BCL2, BAX, Cytochrome C, β-actin가 있으며 이는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 위의 western blot 방법을 이용하여 확인하였다. 또한, Mitogenactivated protein kinase (MAPK) 하위 시그널에 관여하는지 검토하고자 ERK, p-ERK, p38, p-p38, JNK, p-JNK, β- actin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 항 체를 이용하여 분석하였다.
7. 통계분석
모든 실험은 3번 반복하고 실험결과는 평균±표준편차(mean ±Standard deviation)로 표시하였다. 집단 간 차이는 oneway ANOVA로 분석한 후에 Tukey’s method로 사후 검증 하였다. 그래프는 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 p<0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
III. 결과 및 고찰
1. 최종당화산물이 신장세포 생존률 및 RAGE단백질 발현에 미치는 영향
SV40 MES 13 세포에 다양한 농도의 최종당화산물 GOLD와 MOLD <Figure 1A>를 처리한 후, 세포 형태 변 화와 세포 생존율에 대한 영향을 평가하였다. GOLD 처리 세포의 형태는 대조군 세포와 유사했으나, MOLD 처리 세 포는 세포 밀도의 감소와 함께 부유하는 세포 파편의 증가 가 관찰되었다. 또한, GOLD 처리는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으나, MOLD 처리는 농도 의존적으로 세포 생 존율을 감소시켰다<Figure 1B>. 이는 GOLD는 MOLD에 비해 세포생존율에 미치는 영향이 상대적으로 낮아, 세포증 식 억제효과가 낮게 나타나고 MOLD는 고농도에서 세포독 성을 유발하고 세포증식을 억제하는 것을 확인하였다.
다음으로, MOLD와 GOLD가 AGEs 수용체인 RAGE와 단백질 N-결합 글리코실화에 중요한 비촉매 효소인 Dolichyldiphosphooligosaccharide— protein glycosyltransferase noncatalytic subunit (DDOST) 단백질 발현에 미치는 영향을 확 인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다. AGEs 세 포 사멸 데이터에서 예상한 바와 같이 GOLD 처리는 RAGE와 DDOST의 단백질 발현에 영향을 미치지 않았으나, MOLD 처리는 두 수용체의 발현을 유의하게 증가시켰다 <Figure 1C>. 이 결과는 MOLD가 RAGE와 상호작용하여 세포 독성을 유발하며, DDOST는 AGEs 생성에 있어 단백 질의 당화를 돕는 역할을 하기때문에 MOLD 처리 후 발현 의 증가는 생성된 AGEs의 RAGE와의 반응을 촉진할 것으 로 예상할 수 있다.
2. 최종당화산물이 산화 스트레스에 미치는 영향
RAGE 상호작용은 RAGE 및 수용체와 반응한 후 하위시 그널로서 산화 스트레스를 강하게 유발한다(Zhou et al. 2024). 따라서 SV40 MES 13 세포에서 MOLD 및 GOLD 처리 후 세포 내 활성산소종(ROS) 생성을 측정하였다. 1 mM 농도의 GOLD 처리는 DCF-DA 양성 세포의 수를 증 가시키지 않았으나, 1 mM MOLD 처리는 DCF-DA 양성 세포의 수를 현저하게 증가시켰다<Figure 2A>. 다음으로, RAGE의 하위 경로인 항산화 시스템에 변화가 있는지 확인 하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. MOLD 처리는 Nrf2 발현을 유의하게 감소시켰고, Nrf2 하위의 항산화 효소 인 SOD2 및 Catalase의 발현도 크게 감소시켰다. 또한, MOLD 처리는 AGEs 해독 효소중 하나인 Glo1의 발현도 유의하게 감소시켰다. 반면, GOLD 처리는 이러한 단백질들 의 발현에 영향을 미치지 않았다<Figure 2B>. 이러한 결과 는 MOLD-RAGE 상호작용이 Nrf2/SOD2/Glo1 경로를 억 제하여 신장 세포에서 산화 스트레스를 유발함을 알 수 있다.
3. 최종당화산물이 염증 반응에 미치는 영향
AGE와 RAGE 또는 TLR4 간의 상호작용은 염증 반응을 증가시킬 수 있다(Yan et al. 2023). 따라서 두 AGEs가 염 증을 유발하는지, 그리고 그 기전이 RAGE와 TLR4에 의존 적인지 확인하기 위해 TLR4와 관련된 사이토카인의 발현을 조사하였다. GOLD 처리는 TLR4와 염증성 사이토카인의 발 현을 변화시키지 않았으나, MOLD 처리는 TLR4 또는 TRAF6 발현을 증가시키지 않으면서도 IL-1β, IL-6, TNF-α 의 발현을 유의하게 증가시켰다<Figure 3>. 이 결과는 GOLD가 염증 반응에 영향을 미치지 않으며, MOLD는 RAGE와의 특이적 상호작용을 통해 염증을 유발할 수 있음 을 확인하였다.
4. 최종당화산물이 Apoptosis 및 미토콘드리아 막전위 변화 에 미치는 영향
세포와 조직에서 증가한 AGE와 RAGE 수준은 산화적 스 트레스를 유발하고, 결국 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다 (Zhou et al. 2024). GOLD 또는 MOLD 처리가 미토콘드 리아 기능 장애를 유도하는지 확인하기 위해 BCL2 계열 단 백질과 그 하위 신호 전달체의 발현 및 미토콘드리아 막 전 위를 평가하였다. GOLD 처리는 미토콘드리아 관련 단백질 발현 및 산화 스트레스에 영향을 미치지 않았으나, MOLD 처리는 BCL2 발현을 감소시키고, BAX 발현을 증가시켰다. 또한 BCL2 계열 단백질 발현의 변화는 미토콘드리아 Cytochrome C 방출 및 caspase-9의 활성화를 유도하였 다<Figure 4>.
5. 최종당화산물이 자가포식(Autophagy) 유도에 미치는 영향
자가포식은 미토콘드리아 기능 장애에 대한 반응으로 발 생하며, 세포 생존을 위한 기전을 제공한다(Cho et al. 2009). GOLD와 MOLD가 자가포식을 유도할 수 있는지 확 인하기 위해 Western blot 분석과 MuseTM Cell Analyzer 분석을 수행하였다. AKT, mTOR 경로는 자가포식에서 중요 한 역할을 한다. GOLD 처리는 AKT, mTOR 또는 하위 단 백질인 Beclin1의 발현 수준을 변화시키지 않았다. 반면, MOLD 처리는 AKT, mTOR, Beclin1의 단백질 발현 수준 을 유의하게 증가시켰으나, LC3-phosphatidylethanolamine (LC3-II): microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B (LC3-I)의 비율에는 변화를 주지 않았다<Figure 5>. MUSETM 분석 결과 또한 MOLD가 GOLD와는 다르게 경미한 자가포식을 유도하였으며, LC3 발현의 변화가 없어 자가포식소체가 제대로 형성되지 않았기 때문에 MOLD는 경미한 자가포식을 유발했음을 알 수 있었다.
6. 최종당화산물이 MAPK의 활성에 미치는 영향
MAPK는 세포의 성장, 분화, 생존 및 스트레스 반응을 조 절하는 경로의 일부분으로 독성, 산화적스트레스와 같은 외 부자극에 반응하여 활성화 된다(Moens et al. 2013). 본 연 구에서는 최종당화산물 MOLD, GOLD가 MAPK조절에 어 떠한 영향을 주는지 확인하고자 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과, <Figure 6>에서와 같이 MOLD를 신장세포에 처리 하였을 때 ERK의 인산화를 촉진시켰지만, GOLD를 처리하 였을 경우에는 인산화에 변화가 없었고, MAPK의 다른 인 자인 p-38, JNK의 인산화에도 영향을 미치지 않았다. 이는 최종당화산물인 MOLD에 의한 신장손상이 발생할 때 초기 에는 ERK경로를 활성화 시켜 세포 보호 작용을 하여 손상 을 완화하려고 하지만 만성적이고 심각한 독성 노출 시 혹 은 산화적스트레스에 의해 과활성화되어 오히려 신장세포의 사멸을 유도할 것으로 생각된다.
AGEs는 RAGE와의 상호작용을 통해 산화 스트레스, 염증, 세포자멸사를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. AGEs의 축 적은 당뇨병성 신증 및 만성 신장 질환과 같은 다양한 대사 질환을 유발한다(Rabbani & Thornalley 2018). 따라서 AGEs의 축적을 억제하거나 제거하는 것은 대사 질환 치료 의 새로운 방법으로 주목받고 있다. AGEs는 매우 다양하며, 구조적으로 독성이 있는 AGEs와 비독성 AGEs가 보고되었 다. 따라서 AGEs의 활성에 대한 추가 연구가 필요하다 (Takata et al. 2019). AGEs의 독성은 주로 CML, CEL, MG-H1과 같은 잘 알려진 AGEs에서 다양한 조직에 대해 연구되었으나, 동일한 AGEs라도 조직이나 세포주에 따라 다 른 활성을 보일 수 있음이 여러 연구에서 보고되었다(Hayase et al. 2005, Feng et al. 2013, Lee et al. 2020a). 따라서 본 연구에서는 메틸글리옥살과 글리옥살로부터 유래된 AGEs 인 GOLD와 MOLD가 신장 세포에 미치는 영향을 연구하였 다. 세포 독성 실험 결과, GOLD는 SV40 MES13 세포에서 높은 농도에서도 독성을 나타내지 않았으나, MOLD는 농도 의존적으로 독성을 나타냈다. 또한, AGEs 수용체인 RAGE 의 발현이 MOLD 처리에서만 증가했음을 확인하였다. 이러 한 결과를 바탕으로, GOLD는 신장 세포에서 독성이 없는 AGE이며, MOLD는 독성이 있는 AGE라고 예상하였으며, 이러한 패턴이 다양한 경로에서도 동일하게 나타나는지 확 인하였다.
AGE-RAGE 상호작용은 다양한 대사 질환을 유발하며, 산 화 스트레스, 염증, 세포자멸사를 유도할 수 있다(Nowotny et al. 2015). 반면, DDOST 유전자에 의해 암호화된 AGER1은 RAGE 활성화로 유발된 염증과 산화 스트레스를 억제 할 수 있다(Detzen et al. 2019). AGE-R1 비율은 대사 장 애로부터 보호하는 중요한 요인으로 제안되었다. 그러나 예 상과 달리 MOLD 처리는 DDOST와 RAGE의 발현을 모두 증가시켰으며, 따라서 DDOST 비율에는 유의미한 변화가 없 었다. 이러한 결과는 MOLD에 의해 유발된 세포 독성에 대 한 신장 세포의 보호 반응을 반영할 수 있지만, RAGE 발현 증가에 따른 MOLD-RAGE 상호작용이 세포 내 글루코독성 기전에 더 큰 영향을 미쳤을 가능성이 있다.
MOLD-RAGE 상호작용의 증가는 알려진 글리코톡신 기 전 중 산화 스트레스를 유도하는 첫 번째 단계일 수 있다. MOLD 처리는 Nrf2와 그 하위 항산화 단백질, 그리고 AGE 해독에 중요한 Glo1의 발현을 감소시켰다. Nrf2-Glo1 경로 는 AGE 해독에 중요한 역할을 하며, 여러 연구에 따르면 이 기전이 당뇨병과 같은 대사 질환에서 손상된다(Chaudhuri et al. 2018). MOLD에 의한 신장에서의 Glo1 감소는 AGEs의 지속적인 축적으로 이어질 수 있다. 따라서 GOLD와 달리, MOLD의 축적은 이러한 기전을 통해 신장에서 다양한 질병 을 유발할 가능성이 있다.
AGE-RAGE 상호작용으로 유발된 산화 스트레스가 염증 반응을 유발한다는 것은 잘 알려져 있으며(Pathomthongtaweechai & Chutipongtanate 2020), 최근 연구에 따르면 AGE로 유발 된 염증은 TLR4 경로를 통해서도 촉발될 수 있다(Kanda et al. 2017, Liu et al. 2020). AGEs가 RAGE 및/또는 TLR4 에 결합하면 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 다양한 염증성 사 이토카인의 발현이 촉진된다(Ohtsu et al. 2017). GOLD 처 리는 염증성 사이토카인의 수치, 세포 사멸 또는 산화 스트 레스를 증가시키지 않았다. MOLD 처리는 TLR4 발현을 변 화시키지 않았지만, MCP1, IL-1β, IL-6, TRAF6와 같은 사 이토카인의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 MOLD로 유 발된 염증이 TLR4가 아닌 RAGE의 직접적인 영향일 수 있 음을 나타낸다.
미토콘드리아는 ROS 손상의 주요 표적이며, ROS 수치가 증가하면 미토콘드리아 기능이 저하된다(Zorova et al. 2014). 산화 스트레스로 유발된 미토콘드리아 기능 장애는 미토콘 드리아 투과성 전이 구멍을 열어 막 전위를 탈분극시키고 세 포자멸사 인자를 방출하게 한다(Assaly et al. 2012). ROS 수치가 증가하면 BAX가 미토콘드리아 막으로 이동해 막의 무결성을 파괴하고, 이로 인해 미토콘드리아 사이토크롬 c가 방출된다(Zorova et al. 2014). 또한, Karch 등은 BCL2 단 백질의 억제가 미토콘드리아 외막에서 BAX 활성을 증가시 키고 막의 투과성을 높인다고 보고하였다(Karch et al. 2013). 미토콘드리아 기능 장애는 caspase 계열을 활성화하 고 세포자멸사를 유발하므로, MOLD 처리가 BCL2 계열 단 백질의 발현을 변화시켜 미토콘드리아 막 전위를 증가시키 고 결국 세포자멸사를 유도했을 가능성이 있다. 또한, GOLD 는 미토콘드리아 기능 장애를 유발하지 않았으므로, 세포자 멸사를 유도하지 않을 것으로 예상된다. 흥미롭게도, MOLD 처리는 신장에서 보호적 역할을 할 수 있는 자가포식을 유 도하였다(Kimura et al. 2016). 자가포식은 손상된 미토콘드 리아의 분해를 촉진하여 세포자멸사를 억제하며 세포 보호 기능을 한다(Kaushal & Shah 2016). 여러 연구에 따르면 AGE로 유도된 자가포식은 다양한 세포 유형에서 생존을 촉 진하고 산화 스트레스를 감소시킨다. 또한, 자가포식은 리소 좀 생성을 촉진하고 기능을 향상시켜 AGE 축적을 억제한다 (Takahashi et al. 2017, Mei et al. 2019). 그러나 일부 연 구에서는 AGE로 유도된 자가포식이 세포자멸사에 관여한다 고 보고하였다(Lee et al. 2020a). 따라서 AGE로 유도된 자 가포식이 대부분의 질병에서 보호적 역할을 하는지, 해로운 역할을 하는지는 명확하지 않다. 본 연구에서 MOLD는 자 가포식을 유도했으나, Beclin1 발현이 증가한 반면 LC3 발 현에는 변화가 없었으며, 이는 자가포식이 정상적으로 일어 나지 않았음을 시사한다. 따라서 우리는 MOLD가 LC3 변 환을 담당하는 자가포식 관련 단백질(ATG) 계열을 선택적으 로 억제하거나, 직접적으로 이 변환을 억제하여 자가포식을 억제하고 세포자멸사를 촉진한다고 가정할 수 있다. 이전 연 구에서는 자가포식이 활성화된 caspase에 의해 억제된다고 보고되었으나(Cho et al. 2009). 본 연구에서는 Beclin1 발현 이 증가 했으므로 자가포식이 다른 기전을 통해 억제되었을 가능성이 있다. 따라서 MOLD로 유도된 자가포식이 세포를 보호하는 역할을 하며, MOLD는 이러한 보호적 기능을 억 제했다고 볼 수 있다. 그러나 MOLD에 의해 자가포식이 유 도되고 억제되는 기전은 명확하지 않으며, 추가 연구가 필요 하다. 미토콘드리아 기능 장애는 세포자멸사를 유도하는 중 요한 경로로 제안되어 왔다(Zorova et al. 2014). AGEs가 다양한 조직과 세포 유형에서 caspase를 활성화하여 세포자 멸사를 유도하는 것은 잘 알려져 있다. 이전 연구에서는 Cytochrome C 방출이 세포자멸사 개시자인 caspase 9를 활 성화시킨다고 보고되었다(Li et al. 2007). GOLD 처리는 이 러한 caspase들의 발현 수준을 변화시키지 않았으나, MOLD 처리는 절단된 caspase 9의 발현을 증가시켜 caspase 의존적 경로가 세포자멸사에 관여함을 확인하였다. 이러한 결과는 MOLD로 유도된 세포자멸사가 미토콘드리아 기능 장애와 관련이 있음을 시사한다. MAPK 신호 전달 단백질, 즉 p38 MAPK, Janus kinase (JNK), ERK는 세포 증식, 분화, 세포 자멸사를 포함한 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 한다. AGEs가 MAPK 신호 전달을 활성화하는 것은 잘 알려져 있 다. 본 연구 결과, MOLD 처리는 p38 또는 JNK의 인산화 를 유도하지 않았지만 ERK의 인산화를 유도하였다. Ishihara 등은 RAGE가 ERK와 상호작용하여 ERK를 활성화함으로 써 세포 및 조직의 기능 장애를 유발한다고 제안하였다 (Ishihara et al. 2003). 또한 RAGE-ERK 신호 전달이 병리 학적 역할을 한다고 보고되었다(Cai et al. 2016). 이러한 연 구 결과를 바탕으로, 본 연구는 MOLD에 의해 RAGE가 상 향 조절되면서 ERK와의 상호작용을 통해 인산화를 유도하 여 세포자멸사 신호에 변화를 일으킬 수 있음을 시사한다. 또한, 여러 보고에 따르면 p38 및 JNK는 TLR4를 통해 활 성화되어 독성을 유발한다고 알려져 있다. 그러나 본 연구에 서는 MOLD 처리가 TLR4 발현을 증가시키지 않았지만, ERK의 활성화가 증가했을 가능성이 있다. Agabiti 등은 ERK 인산화가 세포자멸사의 후기 단계에서 발생하며, Caspase 활성화의 하위 신호가 아님을 보고하였다(Agabiti & Wiemer 2017). 따라서 MOLD로 유도된 세포자멸사는 미토 콘드리아 손상에 의해 유도된 caspase 경로와 독립적으로, ERK 활성화를 통해 직접적으로 일어날 수도 있다.
이처럼, GOLD와 MOLD가 신장 세포에 미치는 영향은 다양한 기전에서 다르게 나타난다. AGEs의 영향은 각 조직 에 따라 다를 수 있으며, 이는 GOLD와 MOLD 간의 구조 적 차이에 기인할 수 있다. 이전 연구에 따르면, MOLD와 GOLD 모두 염증 및 ROS 기전을 통해 기질 세포에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Lee et al. 2021a, Lee et al. 2021b). 이러한 결과는 MOLD와 GOLD를 고농도로 처리하여 세포 에 직접 손상을 유발하는 현재 연구 모델과는 약간 다르다. 본 연구 결과에 따르면, 세포 내 반응은 AGEs의 농도와 시 간에 따라 다르며, AGEs와 신체 방어 기전 간의 상호작용은 세포 농도에 따라 다르게 작용하는 것으로 보인다. Matsumura 등은 메틸글리옥살이 글리옥살보다 세포에 더 효 율적으로 들어가며 메틸글리옥살의 메틸 그룹 존재로 인해, 세포질 내 GSH와 직접적으로 반응하여 GSH 수준을 낮춘다 고 보고하였다(Akhand et al. 2001). 또한, 메틸글리옥살은 글리옥살보다 훨씬 높은 반응성을 나타내어 당뇨병 합병증 동안 높은 ROS 수치를 유발한다고 알려져 있다(Matsumura et al. 2013). 따라서 MOLD는 메틸글리옥살 유래 AGE로서 매우 독성이 강할 가능성이 있다. 반면, GOLD는 상대적으 로 약한 활성을 보였으며, MOLD와 유사한 농도에서는 독 성을 나타내지 않았다. 본 연구에서는 여러가지 세포중에 AGEs 의 축적이 많이 일어나는 신장세포에서의 독성을 확 인하였지만, 글리옥살 또는 글리옥살 유래 AGEs에 의한 독 성이 신경세포, 근육세포, 간세포 등 다양한 조직 및 세포 유 형에서 보고된 바 있으므로, GOLD와 MOLD가 다른 조직 이나 세포주에 미치는 영향을 추후 연구하는 것이 필요하다.
V. 요약 및 결론
이 연구는 신장 세포에서 AGEs인 GOLD와 MOLD의 독 성을 비교하였다. 결과에 따르면, GOLD는 신장 세포에서 독 성을 나타내지 않았으나, MOLD는 농도 의존적으로 독성을 나타냈다. 특히 MOLD는 RAGE 발현을 증가시키며, RAGE 와의 상호작용을 통해 세포 독성을 유발하였다. 반면, GOLD 는 RAGE 발현에 영향을 미치지 않았다.
MOLD는 또한 산화 스트레스를 유발하고 항산화 경로인 Nrf2와 Glo1의 발현을 억제하여 염증성 사이토카인 발현을 증가시켰다. MOLD 처리는 미토콘드리아 기능 장애를 유도 해 세포자멸사를 촉진하였으며, 반면 GOLD는 미토콘드리아 에 영향을 미치지 않았다. 자가포식은 MOLD에 의해 유도 되었으나 정상적으로 진행되지 않았고, 이는 자가포식이 세 포 보호 기전으로 작용할 수 있음을 시사한다<Figure 7>. 결 론적으로, MOLD는 산화 스트레스, 염증, 미토콘드리아 기 능 장애 및 세포자멸사를 유발하는 독성 AGEs로 작용하는 반면, GOLD는 비독성 AGEs로 기능하였다. MOLD의 강한 독성은 특히 메틸글리옥살 유래 AGE로서 높은 반응성에 기 인하며, 이러한 기전은 대사 질환에서 중요한 역할을 할 수 있다. 추가적으로, MOLD가 자가포식을 억제하면서 세포자 멸사를 촉진하는 정확한 기전과 그 외 다른 조직이나 세포 주에 미치는 영향을 규명하기 위한 추가 연구가 필요하다.