I. 서 론

호노키올(Honokiol; HNK)은 세계 여러 지역에 자생하는 여러 종의 목련속에 속하는 나무의 껍질, 씨알, 잎에서 분리된 리그난이며 magnolol, 4-O-methylhonokiol 및 obovatol과 함께 일부 전통적인 동양 약초에서 화합물 중 하나로 알려져 있다(Anna et al. 2013). 호노키올은 항암(Xi-Rui Chen et al. 2011), 항염증(Peng et al. 2013), 항산화(Kuo- Tong Liou et al. 2003), 신경보호 효과(Yoshiyasu et al. 2002)가 있다고 보고되어 있다. 폴리페놀로 구성되어 있는 호노키올은 세포 에너지 생산 및 생존에 중요한 역할을 하는 세포 내 미토콘드리아에서 중요한 역할을 하여 암세포 사멸 및 전이를 중재하는 데 큰 역할이 알려져 있다(Jing Pan et al. 2016). 그리고 건선 모델에서 항염증 및 항혈관신생 효과가 확장된 항건선 활성까지 보고되었다(Jiaolin et al. 2015). 또한 호노키올은 분자 크기가 작은 폴리페놀 화합물로 알려져있고 높은 친유성 덕분에 혈액뇌장벽(BBB)과 혈액 뇌척수액(CSF) 장벽을 쉽게 통과할 수 있어 척수 손상, 간질, 뇌혈관 손상 등으로 인한 장애의 여러 동물 모델에서 중요한 신경보호 특성을 나타낸다 (Md et al. 2023). 이러한 호노키올의 신경보호 효과로 호노키올 유도체가 주목받고 있다.

비만은 환경, 호르몬 신호 패턴, 유전적 소인, 아디포카인 수용체 결함 및 섭식 장애, 감소된 신체 활동과 같은 수많은 상호 작용과 교란 원인이 있는 복잡한 병리이다. 비만의 진행은 광범위한 심혈관 질환 위험 인자(예: 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 전혈전성 및 전염증성 환경)를 비롯한 추가 병리학적 상태의 발병 소인 증가와 관련이 있다(Phoebe et al. 2008).

지방 조직은 사이토카인과 아디포카인을 생성하는 내분비 기관으로 간주하며(Erin et al. 2004) 지방세포, 지방 전구 세포, 혈관 내피세포, 섬유아 세포 및 대식세포로 구성되며 정상과 비만인 상태에서 중요한 역할을 한다(Herbert et al. 2006).

지방 조직은 혈관이 많이 형성되어 있으며 지방 조직의 확장 및 대사 기능 모두에 충분한 혈류 공급을 유지하는 것이 필수적이다. 혈관 내피는 지방 생성 및 지방 조직 리모델링을 조절하는 많은 인자를 분비한다. 정상적인 조건에서 perivascular adipose tissue (PVAT)는 혈관의 내피 의존적 및 비의존적 이완을 모두 촉진하는 혈관 이완제(예: 지방세포 유래 이완 인자 및 아디포넥틴)의 방출 때문에 항 수축 효과를 발휘한다. 그러나 비만에서 PVAT는 혈관 수축 인자(예: 레닌-안지오텐시노겐-알도스테론 시스템 및 슈퍼옥사이 드의 주요 구성 요소) 및 전염증성 아디포카인(예: TNF-α 및 지방세포 지방산 결합)의 분비 증가로 인해 염증이 심해지고 혈관 기능 장애를 유발한다. 지방 조직에서 아디포카인 및 기타 혈관활성 인자의 비정상적인 분비는 비만 관련 대사 및 혈관 합병증의 발병 및 진행에 주요한 원인으로 알려져 있다(Ping et al. 2013).

지방 조직의 치밀한 혈관 구조는 필요한 산소와 영양분을 제공하고, 식사 또는 공복 상태에서 지방세포로의 연료 전달을 지원한다. 더욱이, 지방 조직의 혈관계는 새로운 지방세포를 생성하고 조직 복구에 필요한 다능성 전구 세포로 구성되기도 하며 단백질, 핵산 및 소기관의 엑소좀 전달을 포 함하는 세포가 통신방식에 중요한 역할을 한다고도 알려졌다(Silvia et al. 2022).

최근 항비만 효과를 나타내는 천연물 및 식품 소재의 개발이 다양하게 이루어지고 있지만 본 연구에서 목적은 호노키올의 항비만 효과를 나타내는 새로운 기전 및 관련 인자를 제시하고자 고지방 식이로 유도된 비만 모델에서 호노키올 투여로 지방 조직 내 혈관 신생의 조절 및 혈관 투과성 조절에 대한 기전 내용을 밝혀내고자 하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 재료 및 방법

본 실험에서 사용한 호노키올은 Sigma-Aldrich(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 고지방 식이 및 일반식이 사료는 Research Diet (New Brunswick, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2. 동물

수컷 C57BL/6 마우스(8주령)는 찰스리버코리아(대한민국 서울, 20-30 g 체중)에서 구입하였다. 마우스는 12시간/12시간 명/암 주기 하에서 22-26°C의 온도에서 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 특정 병원균이 없는 환경에 수용되었다. 모든 동물실험은 한국식품연구원(KFRI) 동물 윤리위원 회의 윤리 규정 및 이용지침에 따라 실시하였다(KFRI-M- 17056). 마우스를 다음과 같이 각각 10마리씩 세 그룹으로 무작위로 맹목적으로 분류하였다: 그룹 1, 일반 식이(ND) 그룹은 8주 동안 물과 사료를 섭취하였다. 그룹 2, 비만 그룹은 8주 연속 고지방 식이(high fat diet; FHD)를 섭취하였다. 그룹 3 , 호노키올(HNK) 그룹은 HFD는 사료로 공급받고 호노키올(50 mg/kg)을 연속 8주 동안 경구투여를 시행하였다. 일반 식이 그룹의 생쥐는 8주령부터 시작하여 각각 8주 동안 지방 10%의 칼로리를 제공하는 표준 사료와 60% 지방으로 구성된 HFD를 먹였다. 음식의 무게와 섭취량을 매주 체크하고 8주 후에 희생하였다.

3. 조직병리학적 분석

지방 조직 절편을 4% 파라폼알데하이드에 고정하고 파라핀 블럭에 고정하였다. 파라핀 블록을 4 μm 결장 절편으로 잘라 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E)으로 조직학적으로 평가하였다. 염색된 슬라이드는 Nikon Eclipse 80i 광학 현미경(Nikon Instruments Inc., Melville, NY)에서 촬영하였으며, 디지털 이미지 분석 프로그램(Image J, Soft Imaging System, Münster, Germany) 소프트웨어를 사용하여 배율 ×400에서 지방 방울 직경을 측정하였다.

4. 면역 형광 염색

마우스의 부고환 지방 조직은 1% 파라폼알데하이드로 고정 후 이전과 같이 조직 통째로 염색을 하였다(Jung et al. 2012). 5% 염소 혈청과 0.3% Triton X-100이 포함된 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 1 h 동안 blocking 처리하였으며, 혈관 염색을 위해 햄스터 항- PECAM-1(Chemicon International, Temecula, CA)과 대식 세포 염색을 위해 항-F4/80 (BD Pharmingen Bioscience, San Diego, 캘리포니아), 지방세포 염색을 위해 BODIPY^® 493/503 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 4°C에서 밤새 반응시켰다. PBS 버퍼로 세척 후 C y3 -접합 항-햄스터 IgG 2차 항체와 Cy5-접합 항-랫트 IgG 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)로 반응시켜 이미지는 LSM 510 META 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Carl Zeiss)을 통해 촬영하였다.

5. 혈관 투과성 분석

Evans blue (30 mg/kg, Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 혈관 투과성 분석을 시행하였다. 1% Evansblue 염료를 0.9% NaCl 용액에 희석하여 마우스 꼬리의 정맥 내 주사(40 μL 주사/20 g 마우스)한 후, 부고환 지방 조직을 분리하여 촬영하였다. 투과성 정도를 정량화를 위해서 조직을 포름아마이드 용액에 18시간 동안 처리하여 원심분리기로 상층액 수확하여 620 nm에서 흡광도 측정하였다.

6. ELISA 및 정량적 실시간 PCR 분석

ELISA는 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay)법으로 항체나 항원에 효소를 표지하여 효소의 활성을 측정하는 방법으로 부고환 지방 조직에서 monocyte chemoattracted protein-1 (MCP-1)에 대한 ELISA를 측정하였다. 마우스의 부고환 지방 조직으로부터 TRI (MRC, Cincinnati, OH)을 사용하여 RNA를 추출하였으며 역전사 후에 cDNA를 만들어 SYBR^® Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 사용하여 7900HT Fast Real- Time PCR 시스템에서 정량적으로 실시간 PCR을 시행하였다. 프라이머는 다음과 같다. 마우스 TNFa, 전방 프라이머: 5'-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3', 역방향 프라이머: 5'- CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3' 마우스 IL-1β, 전방 프라이머: 5'-GGTCAAAGGTTTGGAAGCAG-3', 역방향 프라 이머: 5'-TGTGAAATGCCACCTTTTGA-3', 마우스 CD11c, 전방 프라이머: 5'-CACTCAGTGACTGCCCAAAA-3', 역방향 프라이머: 5'-CCTCAAGACAGGACATCGCT-3', 마우스 CCL2, 전방 프라이머: 5'-ATTGGGATCATCTTGCTGGT-3', 역방향 프라이머: 5'-CCTGCTGTTCACAGTTGCC-3', 마우 스 arginase-1, 전방 프라이머: 5'-TTTTTCCAGCAGACCA GCTT-3', 역방향 프라이머: 5'-AGAGATTATCGGQGCGCC TT-3' 마우스 Fizz1, 전방 프라이머: 5'-CTGGATTGGCAA GAAGTTCC-3', 역방향 프라이머: 5'-CCCTTCTCATCTGC ATCTCC-3', 마우스 CD206, 전방 프라이머: 역방향 프라이머: 마우스 TGFb1, 전방 프라이머: 5'-CAACCCAGGTCCT TCCTAAA-3', 역방향 프라이머: 5'-GGAGAGCCCTGGATA CCAAC-3'

7. 통계분석

데이터는 평균±SD로 표시되었고, 파라메트릭 데이터의 경우 Student’s t-test와 텍스트에 지정된 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 유의성을 결정한 후 Tukey의 사후 테스트를 수행하였다. 비모수적 데이터는 Mann-Whitney U 또는 Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 사후 테스트를 사용하여 분석되었다. p<0.05의 통계값에 대해 유의성을 표시하였다.

III. 결과 및 고찰

1. 호노키올이 비만 쥐에 끼치는 영향

실험 기간 HFD 대조군은 ND 군보다 총 체중 증가량이 유의적으로 높았다. HFD에 의한 체중증가가 시작된 2주 차부터 호노키올 투여군은 HFD군에 비해 체중이 유의적으로 감소하였고<Figure 1C>, HFD를 투여한 비만 마우스의 부고환 지방세포의 평균 직경은 ND 투여 마우스에 비해 약 5배 크게 증가하였는데, 실험 종료 시점에 호노키올 투여군은 지방 방울의 직경을 3 .6배까지 현저하게 감소시켰다<Figure 1B>. H&E 염색을 통한 조직학적 결과에서도 지방세포의 크기를 확인할 수 있다<Figure 1A>. 이와 같은 결과는 호노키올의 항비만 효과를 입증하는 결과로 해석된다.

2. 호노키올이 지방 조직에서 혈관에 끼치는 영향

지방세포 크기에 따른 부고환 지방 조직의 혈관 밀도에 대한 호노키올의 영향을 평가하기 위해 부고환 지방 조직에서 BODIPY 양성 지질 방울과 PECAM-1 양성 내피 세포의 밀도를 전체 마운트 염색으로 평가하였다. 지방 조직의 무게 및 지방 방울의 직경은 비만 마우스에서 증가했고 크기는 호노키올에 의해 감소하였다<Figure 2A, B, D>. HFD로 유도된 비만 마우스의 부고환 지방 조직에서 PECAM-1 양성 밀도는 ND를 투여한 군보다 유의하게 높았고 호노키올 투여군은 증가한 PECAM-1 양성 혈관의 영역을 감소시켰다 <Figure 2A, C>. 백색 지방 조직의 성장(growth)은 조직 내 모세혈관 네트워크의 지속적인 리모델링이 필요하고 지방 조직의 확장(expansion)은 혈관신생(angiogenesis)과 기존 모세 혈관의 확장 및 리모델링이 필수적이다. HFD에 의한 지방 세포 크기가 커짐에 따라 지방 조직 내 혈관신생이 증가하였고 이는 지방 조직의 확장에 따라 기인한 결과라고 보이며 호노키올이 지방 조직 내 혈관 밀도를 감소시켜 지방 조직의 크기를 감소시킨 결과라 생각한다.

3. 호노키올이 지방 조직으로 침윤된 대식세포에 끼치는 영향

부고환 지방 조직에서 F4/80 양성 대식세포 수의 변화를 평가하기 위해 면역형광염색을 실시하였다. PECAM-1 양성 혈관 주위의 F4/80 양성 대식세포의 침윤은 ND 투여 마우스에 비해 3배 이상 증가하였고, 호노키올과 함께 투여한 군은 F4/80 양성 대식세포의 축적을 약 33 % 감소시켰다. 이로 써 호노키올은 비만 마우스의 부고환 지방 조직에서 대식세포 침윤의 증가를 조절한다<Figure 3A, B>. 이와 같은 결과는 염증이 심화되고 지방 조직이 확장되는 단계에서 필요한 전사인자 및 싸이토카인를 분비하고 매개하는 대식세포의 활동을 호노키올이 저해시키려는 효과로 생각한다.

4. 호노키올이 지방 조직의 혈관 투과성에 끼치는 영향

조직에서 혈관은 조직에 영양분을 공급하거나 노폐물을 제거하는 중요한 기능이 있기 때문에 혈관 투과성의 변화는 급성 및 만성 염증에서 흔히 볼 수 있다(Janice A. Nagy et al. 2008). 혈관 투과성 변화를 확인하기 위해 evans blue dye를 마우스 혈관에 주입하여 지방 조직에 퍼지는 정도를 측정하고 dye의 양을 정략적으로 조사한 결과, HFD에 의한 비만쥐의 부고환 지방은 dye가 많이 퍼져있음을 확인하였고, 호노키올 투여군은 감소된 결과를 나타낸다<Figure 4A, B>. 이는 부고환 지방 조직에서 PECAM-1 양성 혈관들의 증가는 혈관 투과성이 증가하였음을 의미하고 호노키올이 혈관 투과성을 감소시킨 결과이다. 이로써 호노키올이 지방 조직 내 증가한 혈관 투과성을 감소시킴으로써 비만과 같은 만성 염증 상태의 조직 내 손상, 혈관내피의 기능부전을 조절 할 수 있다는 결과로 생각된다.

5. 호노키올이 지방 조직의 분극화된 대식세포에 끼치는 영향

대식세포는 선천 면역세포의 일종으로 염증반응을 일으키거나 항염증성 사이토카인을 분비해 조직을 재생하는 역할도 한다. 환경에 따라 표현형과 기능이 달라지기 때문에 대식세포의 분극화(polarization)가 되는데 이는 M1(classically activated)대식세포 또는 M2 (alternatively activated) 대식세포로 분류된다(Alistaire et al. 2021). 고지방 식이 군의 부고환 지방에서 ELISA를 실시한 결과, 대식세포를 유인하는 싸이토카인으로 알려진 MCP-1의 수치가 ND 군보다 HFD군에서 약 1.7배 증가하였고, 호노키올에 의해 3 0% 감소한 것으로 나타났다<Figure 5B>. 부고환 지방 조직에 침윤된 대식세포의 표현형에 따른 변화를 확인하기 위해 정량적 실시간 역전사 PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. 비만쥐의 부고환 지방에서는 M1 대식세포(F4/80, TNF-α, mIL-1β, CD11c 및 CCL2) 및 M2 대식세포(Arginase-1, FIZZ1, CD206 및 TGF-β1) 마커의 mRNA 발현이 유의하게 증가되었으며 호노키올을 투여한 비만 마우스는 부고환 지방 조직에서는 F4/ 80, TNF-α, mIL-1β, CD11c, CCL2, Arginase-1, FIZZ1, CD206 및 TGF-β1 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다 <Figure 5C-J>. 이 결과는 호노키올이 비만쥐의 지방조직의 MCP-1 및 대식세포 M1, M2 대식세포 모두의 표현형에 영향을 줌으로써 대식세포의 침윤을 저해시키는 효과로 항염증 효과를 나타낸 것으로 해석된다.

IV. 요약 및 결론

본 연구에서는 호노키올의 항비만 효과를 확인하기 위해, 동물실험을 통해서 항비만 효과를 입증하고 그 기전으로 혈관 밀도의 변화 및 혈관 투과성을 조절하여 면역세포의 침윤까지 억제하는 효과를 확인하고자 하였다. 고지방 식이(HFD)로 비만을 유도하고 호노키올을 경구로 함께 투여한 결과 체중이 감소하였고, 지방 조직의 지방 방울의 직경 또한 감소하였다. 이때 지방 조직 내 지방 방울이 커짐에 따라 혈관의 밀도 및 침윤된 대식세포도 증가하였으며 호노키올에 의해 모두 감소하였다. 비만에 의해 증가한 지방 조직 내 혈관 투과성도 증가하였으며 호노키올이 혈관 투과성도 감소시켰다. 지방 조직이 증가할수록 대식세포의 침윤이 증가함에 따라 M1/M2 대식세포 표현형의 변화도 호노키올에 의해 모두 감소시키는 결과는 조직 내로 대식세포의 침윤 자체를 억제한 결과로 확인되었다. 추후, 대식세포의 분화 실험을 통하여 호노키올의 대식세포의 표현형에 미치는 영향에 대한 실험이 요구된다.

또한 호노키올은 다양한 건강효과가 알려졌지만 대부분 추 출하여 순도를 높인 호노키올 형태로 건강 보조제로 활용되며 식품에 함유된 호노키올의 섭취는 목련 껍질을 우려내어 만든 차나 전통 한약재 등의 활용으로 다소 제한적이다. 추출물의 효과는 사람을 대상으로 한 임상 테스트에서 호노키올이 1.5% 이상 표준화된 목련 껍질 추출물을 섭취한 사람들은 코르티솔 수치의 변화를 조절하여 체중이 유지되거나 감소한 것으로 나타났으며 (Robert et al. 2006) 같은 투여 추출물로 마우스에 투여한 결과도 지방 생성 및 산화를 억제하여 항비만 효과를 나타내었다(Park et al. 2024). 본 연구 결과에서는 호노키올의 혈관 신생의 조절 및 혈관 투과성을 조절하여 항비만 효과를 입증하였으며 호노키올이 함유된 건강 보조제 및 목련피 차 등의 섭취로 그 효과를 기 대할 수 있겠다.