I. 서 론

궤양성 대장염(ulcerative colitis: UC)과 크론병(Crohn’s disease: CD)은 대표적인 염증성 장질환(IBD)으로 주로 미국 이나 유럽 등 서구에서의 발생 빈도가 높았으나, 최근에는 우리나라의 염증성 장질환 유병률과 발병률이 아시아에서 가 장 높은 편으로 증가하고 있는 추세이다(Ng et al. 2016;Yang et al. 2016;Kwak et al. 2019). 염증성 장질환의 발 병 원인은 아직 불분명하여 확실한 예방법이 없는 실정이지 만, 가족력, 서구화된 식습관, 흡연, 소염진통제 및 면역 체 계 장애 등의 유전적 및 환경적 요인이 있을 수 있다 (Baumgart & Carding 2007;Ramos & Papadakis 2019). 염증성 장질환은 전염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) 등이 과도하게 분비되 면서 증상을 악화시켜 설사, 혈변, 체중 감소 등의 증상을 나 타낸다(Xing et al. 2022). 일반적으로 dextran sulfate sodium (DSS)으로 염증을 유도한 후 염증과 장관 면역에 대 한 연구가 사람의 궤양성 대장염과 유사하기 때문에 DSS를 대장염 동물모델로 유도시 널리 사용하고 있다(Jing et al. 2017;Peng et al. 2020;Chen et al. 2021).

수용성 비타민인 비타민 B 복합체 또는 비타민 B군은 B1 (Tiamin; 티아민), B2 (Riboflavin, 리보플라빈), B3 (Niacin, 니아신), B5 (Pantothenic acid; 판테톤산), B6 (Pyridoxin; 피리독신), B7 (Biotin; 비오틴; Vitamin H), B9 (Folic acid; 엽산), B12 (Cobalamin, 코발라민) 8종류로 세포 대사, 면역력 향상, 피로 회복, 에너지 생성에 도움을 준다(Wan et al. 2022). 이 중 리보플라빈은 쇠고기, 닭고기, 생선과 같은 동물성 식품이나 우유, 치즈, 요거트와 같은 유제품에 다량 함유되어 있으며, 곡류, 동물의 간, 버섯, 시금치, 브로콜리, 아스파라거스 등에서 많이 함유되어 있다(Buehler. 2011). Levit et al. (2018)은 리보플라빈을 생산하는 균주로 알려져 있는 락틱 엑시드 박테리아(lactic acid bacteria, LAB)는 TNBS (trinitrobenzoene sulfoic acid, 티엔비에스)에 의해 유 도된 대장염 동물 모델에서 항염증 및 항산화 효과를 가지 며, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6의 생성을 감소시키는 결과를 보고하였다(Menezes et al. 2017, Levit et al. 2018).

이에 근거하여 본 연구에서는 리보플라빈의 만성 궤양성 대장염의 예방 및 치료에 활용될 수 있는 근거를 마련하고 자 DSS로 유발된 만성 궤양성 대장염에 리보플라빈의 항염 증 효과 및 관련 조절 기전을 관찰하고자 하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 실험동물

본 실험에 사용된 실험동물 마우스는 C57BL/6 (체중 20- 22 g, 수컷)종으로 오리엔트(Seongnam, Korea)로부터 구입하 여 일주일간 적응 및 안정 기간을 거친 후 실험에 사용하였 다. 실험 동물은 온도 22±2°C; 습도 55-60%로 유지하고 1 일 1 2시간 주기로 명암을 교대하였으며, 사료와 물을 충분히 공급하였다. 모든 실험은 한국식품연구원 동물윤리위원회의 윤리 규정에 의거하여 실시하였다(KFRI-M-22032).

2. Dextran sulfate sodium(DSS)에 의한 만성 대장염의 유 발 및 시료의 경구 투여

순화 기간 종료 후, 마우스의 체중을 측정 후, 평균 체중 을 기준으로 무작위로 군당 8마리씩 3군: 정상군(Cont), 대 조군(DSS), 리보플라빈 식이군(DSS+Libof)으로 나누었다. 만 성 대장염을 유발하기 위해 2% DSS (molecular weight 36,000-50,000 Da; MP Biochemicals, Santa Ana, CA, USA) 와 음용수를 일정 주기로 반복적으로 자유 급수하였다. 정상 군에는 음용수를 자유 급수하였고 DSS군에는 1주기는 DSS 와 음용수를 각 5일씩 투여하였으며, 2주기는 각 3일과 7일, 3주기는 각 3일과 7일씩 투여하였다. 시료는 처음 DSS를 투 여하는 시작 일부터 실험 종료일까지 총 30일간 경구투여 하 였다(Son et al. 2023). 정상군과 대조군은 멸균 음용수, 리 보플라빈 식이군에는 리보플라빈(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 37.2 μg/kg bw 농도로 멸균 음용수에 희석하여 200 μL 시료를 경구투여 하였다. Balb/c 마우스(6주)에 리보 플라빈을 하루에 40 μg/mL을 투여하면 항염증 효과가 있다 고 보고 한 것을 참고하여 농도를 설정하였다(Levit et al. 2018).

3. DSS로 유도된 대장염 모델의 질병 활성화 지수 평가

질병 활성화 지수(disease activity index, DAI)는 크게 체 중감소, 변의 상태, 혈변의 유무를 육안으로 확인하여 각 상 태에 따라 점수를 부여한 후 계산하였다. 체중감소의 경우 감소가 0%는 0점, 0-10%는 1점, 11-15%는 2점, 16-20%는 3점, 20% 이상은 4점을 부여하였다. 변의 상태는 정상적인 경우 0점, 약간의 묽은 상태는 2점, 설사의 경우는 4점을 부 여하였다. 혈변이 없는 경우 0점, 혈변이 있는 경우 4점을 부 여하였다.

4. 장기 적출 및 대장 길이 측정

2% isoflurane (BKPharm Corp., Goyang-si, Republic of Korea)으로 동물을 마취한 후, 후대정맥에서 혈액을 채취한 후 맹장에서부터 항문까지 분리하여 생리식염수에 담가 겉 에 묻어 있는 혈액과 지방을 제거하고 흡습지에 수분을 제 거한 뒤 대장의 길이를 측정하였다. 맹장을 분리한 뒤, 대장 내부를 생리식염수로 세척한 이후 상행 결장은 -80°C 초저 온 냉동고에 보관하고, 하행 결장은 10% formalin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 사용하여 보존하였다.

5. H&E를 통한 조직학적 분석

10% formalin에 보존된 마우스의 대장 조직을 절단하여 파 라핀으로 고정하고 조직 슬라이드의 파라핀을 제거하기 위 해 xylene 용액에 5분간 3회 담근 후, 100, 95, 70% ethanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 에 차례대 로 5분씩 담갔다. 염색을 위해 hematoxylin (DAKO Co., Glostrup, Denmark)용액에 약 5분 동안 염색한 뒤 흐르는 물에 수세하였다. 1% HCl 용액과 1 % 암모니아 용액을 이 용하여 세포질의 hematoxylin을 제거하고 eosin (DAKO Co., Glostrup, Denmark) 용액에 2분간 세포질을 염색하였다. 이 후 70, 95, 100% ethanol, xylene에 차례대로 5분 동안 담 근 뒤 cover glass를 덮어 봉입하였다. 슬라이드 위에서 염색 된 부위의 다섯 곳을 선택 한 후 현미경(Nikon Eclipse Ti confocal microscope, Tokyo, Japan)으로 사진을 찍었다.

6. 세포 배양 및 세포 처리

마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주 은행(Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (American Type Culture Collection, ATCC, Manasssas, VA, USA)와 penicillin (100 U/mL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)과 streptomycin (100 μg/mL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 넣은 dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, ATCC, Manasssas, VA, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2-3일에 한 번 씩 계대 배양을 수행하였다.

7. 세포 생존율

세포 생존율은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan) 분석법을 이용하였다. RAW264.7 세포는 48-well plate에 1 × 10⁵ cells/well을 분주 하여 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 다음, 1시간 뒤 대조군을 제외한 모든 그룹에 lipopolysaccharide (LPS, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 1 μg/mL 처리하였 다. 20시간 배양한 후 CCK-8 시약을 첨가하여 2 h 동안 5% CO₂, 37°C 배양기에서 배양하였다. ELISA reader (BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡 광도를 측정하였으며, 대조군 대비 백분율로 나타내었다.

8. 단백질 발현 측정

RAW264.7 세포는 6 well에 1 × 10⁵ cells/well로 24시간 배양 후 농도별로 시료를 처리한 다음, 1시간 뒤 대조군을 제외한 모든 그룹에 LPS (1 μg/mL)를 20시간 처리하였다. 이후 PBS로 세포 세척 후, lysis buffer를 세포에 분주하여 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단 백질 농도는 BCA kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 1 2%의 polyacrylamaide gel에 전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유에 넣고 상온에 서 blocking 시킨 후, 1차 항체 inducible nitric oxide synthase (iNOS) antibody (Cell signaling, Danvers, MA, USA), β-actin antibody (Santacruz, Dallas, TX, USA)에 1:1000 희석한 후 4°C에서 overnight시킨 후 다음 2차 항체 를 반응시켰다. Specific band는 ECL solution (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 chemidoc XRS+ imaging system (Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 통해 측정하였다.

9. NO 발현 저해능 측정

RAW264.7 세포를 48-well plate에 1 × 10⁵ cells/well로 분 주하여 24시간 배양하였다. 시료를 농도별로 처리한 다음, 1 시간 뒤 대조군을 제외한 모든 그룹에 LPS를 1 μg/mL 처리 하였다. NO assay (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) 를 위해 세포를 20시간 배양 후 상등액을 따서 각 well의 상 등액 1 00 μL와 nitrite ion standard solution (0, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 μM) 100 μL씩을 동량의 Griess reagent와 혼합하여 상온에서 호일로 차광하고 1 5분간 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 농도는 nitrite ion standard solution에서 얻어진 standard curve를 이용하여 산출하였다.

10. 사이토카인 발현 저해능 측정

RAW264.7 세포를 48-well plate에 1 × 10⁵ cells/well로 분 주하여 24시간 배양하였다. 시료를 농도별로 처리한 다음, 1 시간 뒤 대조군을 제외한 모든 그룹에 LPS를 1 μg/mL 처리 하였다. 20시간 배양 후 상등액을 따서 세포 배양액 내의 TNF-alpha, IL-6의 농도는 BD OptEIA^TM Set ELISA (TNF-alpha, IL-6, Franklin Lakers, NJ, USA)의 protocol을 따라 실험하여 측정한 후 ELISA reader (BioTek Instruments Inc. USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

11. 통계처리

모든 실험의 결과는 평균값±표준 오차 평균(mean±SD)으 로 표현하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Graph pad 9.0 program를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후 검정은 Tukey test를 적용하여 분석하였다. p<0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

III. 결과 및 고찰

1. DSS로 유도된 대장염에 대한 리보플라빈의 질병 활성화 지수에 대한 효과

염증성 장질환은 크론병과 궤양성 대장염으로 나뉜다. 궤 양성 대장염은 최근 서구화된 식습관과 스트레스 등의 여러 가지 원인과 과학기술의 발전으로 인한 진단 방법의 발달로 인해 한국에서 증가하는 추세이다(Yang et al. 2021). 염증성 장질환중 궤양성 대장염의 동물실험 연구모델로 DSS를 활 용한 장염 모델이 가장 일반적으로 활용되고 있는 동물 모 델로, 인간의 염증성 장질환과 유발된 장염의 형태가 비슷하 다고 알려져 있다(Chassaing et al. 2014).

DSS 유발 대장염 동물 모델은 음용수에 희석한 DSS를 흰 쥐, 마우스 및 햄스터에 급수하여 대장염이 유발되는 경우, 혈변, 체중 감소, 대장의 축소 및 점막 궤양 등이 유발되고 대장 상피세포의 손상으로 장 상피층의 장샘이 염증 없이 떨 어져 가는 것으로 알려져 있다(Oh et al. 2013). 장기 투여 시 발암 단계의 변화가 발현되며, 재현성이 높은 모델로서 염증성 장질환, 특히 궤양성 대장염의 새로운 약제 효능 평 가에 많이 사용되는 오래되고 안정적인 실험 모델 중의 하 나다(Susana et al. 2012). 염증성 장질환 중 크론병은 TNBS을 음수하여 실험동물 모델을 유발 할 수 있다고 알려 져 있다. Levit et al. (2018)은 리보플라빈의 식이는 TNBS 에 의해 유발된 염증성 장질환의 개선 효과가 있음을 보고 하였다. 이들의 연구와는 조금 다르게 본 과제에서는 만성 대장염을 유발하기 위해 2% DSS와 음용수를 3주기로 반복 하면서 리보플라빈을 처음 DSS를 투여하는 시작 일부터 실 험 종료일까지 총 30일간 경구투여 하였다<Figure 1A>. 그 결과 실험 종료일인 30일차의 경우, 체중변화량은 정상군에 비해 DSS를 처리한 군에서 감소한 반면(p<0.01), 리보플라 빈을 처리한 군에서는 회복되는 것을 확인하였다(p<0.05) <Figure 1B>. 또한, 체중감소, 변의 묽기, 혈변 정도를 확인 하여 질병 활성화 지수의 점수의 변화를 평가하였다. 그 결 과, 질병 활성화 지수의 점수는 최종일에 정상군에 비해 DSS를 처리한 군에서 감소한 반면(p<0.01), 리보플라빈을 처 리한 군에서는 회복되는 것을 확인하였다(p<0.05)<Figure 1C>. 따라서, 리보플라빈의 식이는 만성 궤양성 대장염의 질 병 활성화 지수를 억제함으로 염증성 장질환에 대한 개선효 과가 있음을 확인할 수 있었다.

2. DSS로 유도된 대장염에 대한 리보플라빈의 대장 길이 증 가 효과

염증성 장질환은 체중 감소, 출혈과 점액을 동반하는 설사 등의 인자를 통해 평가되고 결장의 길이 축소를 유도하기 때 문에 대장의 길이는 대장 보호 효과를 평가하는 중요한 지 표로 이용되고 있다(Lin et al. 2022).

따라서, 실험 30일차에 마우스를 희생하여 맹장을 포함한 대장의 길이를 측정하였다. 그 결과, 정상군에서는 평균 8.08 cm, DSS군은 평균 5.84 cm 유의하게 단축됨을 확인하였으 며(p<0.001), 반면 리보플라빈을 처리한 군에서 평균 6.9 cm 으로 다시 증가함을 확인하였다(p<0.01)<Figure 2A and 2B>. 본 결과를 통해, 리보플라빈은 염증성 장질환으로 인한 대장 길이 축소에 대한 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

3. DSS로 유도된 대장염에 대한 리보플라빈의 조직학적 변 화 분석

DSS유발 장염 동물모델의 대장조직에서는 대장 점막 구조 의 파괴, 궤양을 형성하여 염증성 단핵구나 대식세포와 같은 광범위한 염증세포 침윤, 점막고유층(lamia propria)를 두껍 게 만든다(Susana et al. 2012). 이러한 변화를 관측하기 위 하여 H/E 염색을 실시한 결과 정상군에서는 정상적인 선와 (crypt) 형상을 나타내었으며, 배상세포(goblet cell)가 풍부하 고 점막이 두꺼워지는 현상이나 궤양 역시 전혀 관측되지 않 았다. 이에 반해 DSS군에서는 핵의 파괴, 점막과 점막 하에 염증세포의 침윤, 상피 조직의 손실 등이 관측되었으며, 이 러한 손상은 리보플라빈을 처리한 군에서 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다<Figure 2C>. 본 결과를 통해, 리보플 라빈은 염증성 장질환으로 인한 조직의 손상을 억제하는 효 과가 있음을 확인 할 수 있었다.

4. RAW 264.5 cell에서 리보플라빈의 세포 독성 평가

리보플라빈의 세포 독성을 평가하기 위해 RAW264.7 세포 에 리보플라빈을 25, 50 μg/mL 농도로 1시간 처리한 뒤 대 조군(Cont)을 제외한 모든 그룹에 LPS (1μg/mL)을 처리 후 18시간 동안 배양하였다. CCK-8 assay를 이용하여 세포생존 율을 측정한 결과, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 세포생 존률은 감소하였으나, 리보플라빈을 같이 투여 하였을 때에 세포 생존률의 차이를 나타내지 않았다<Figure 3>. 이상으로 결과로 보아 리보플라빈은 RAW264.7 세포에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

5. RAW 264.5 cell에서 리보플라빈의 염증성 사이토카인 생 성 억제 효능

체내에서 염증반응은 다양한 생화학적 반응이 연관되어 있 으며, 특히 면역세포들에 의해 방어 반응을 활성화시켜 염증 반응이 시작되거나 조절된다. 면역세포들은 NO, 또는 프로 스타글라딘 E2 (prostaglandin E2, PGE2) 등의 영향을 받아 혈관을 통해 손상된 곳으로 이동하여 염증반응을 시작한다. 이동한 면역세포는 TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인을 분비 한다고 알려져 있다(Jeon et al. 2021). TNF- α는 면역세포 의 조절이라는 중요한 역할을 하는 물질로서, IL-6와 IL-1 β 의 분비를 자극한다.

따라서, 본 연구에서는 염증유발인자로 널리 이용되는 LPS 를 RAW 264.7 세포에 처리하면서 리보플리빈을 농도별로 처리하였다. 그 결과 Cont에 비해 LPS를 처리한 군에서 TNF-α, IL-6의 생성이 유의하게 증가하였다(p<0.0001). 그러 나, 리보플라빈을 처리시 이들의 생성은 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.0001)<Figure 4>. 이상 의 결과로 보아 리보플라빈은 RAW 264.7세포에서 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 효과가 있다고 추정된다.

6. RAW 264.5 cell에서 리보플라빈의 NO 생성, iNOS 발현 억제 효능

NO는 염증반응에서 중요한 역할을 하는 조절인자로써 NOS에 의해 L-arginine으로부터 생성되며, iNOS는 염증반 영에 관여하는 대식세포에서 NO를 생성하여 염증반응을 촉 진하는 역할을 한다. 염증반응이 일어나게 되면 관련 세포에 서 iNOS의 과발현에 의한 다량의 NO의 생성은 세포독성물 질등으로 작용, 병리적인 상태를 유도하여 유전자 변이, 신 경 및 조직 손상이 유발된다고 알려져 있다(Nagata et al. 2019). 따라서, 본 연구에서는 다량의 iNOS, NO의 생성은 여러가지 염증성 질환 중 염증성 장질환의 병리적인 상태와 밀접한 관련이 있음을 확인하고자 하였다.

따라서, 본 연구에서 리보플라빈이 염증지표인자로 알려진 NO의 생성에 영향을 미치는지 보고자 하였다. 그 결과 LPS 를 RAW 264.7 세포에 처리하면서 리보플리빈을 농도별로 처리한 결과 Cont에 비해 LPS를 처리한 군에서 NO 생성이 증가하였으나(p<0.0001), 리보플라빈을 처리시 농도에 의존 적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(p<0.0001)<Figure 5>. 또한, 리보플라빈이 염증지표인자로 알려진 iNOS의 발 현에 영향을 미치는지 보고자 WB을 실시하였다. LPS를 RAW 264.7 세포에 처리하면서 리보플리빈을 농도별로 처리 한 결과 Cont에 비해 LPS를 처리한 군에서 iNOS 단백질 발현이 증가하였으나(p<0.0001), 리보플라빈을 처리시 농도 에 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다 (p<0.05)<Figure 6>.

따라서 RAW 264.7 세포에서 리보플라빈은 염증 인자인 iNOS 발현 및 NO 생성을 억제하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

IV. 요약 및 결론

본 연구에서는 리보플라빈의 항대장염 효능을 확인하기 위 해 in vivo와 in vitro 실험을 진행하였다. 마우스에 리보플라 빈과 DSS를 함께 경구 투여한 후 대장염의 임상적 증상 및 염증지표들의 분석, RAW 264.7에 리보플라빈을 처리 후 염 증지표들의 변화를 분석하였다. 그 결과 리보플라빈의 투여 는 DSS에 의해 유도된 마우스 대장 염증 증상의 마커들, 즉 체중 감소, 혈변, 설사를 포함한 질병 활성화 지수, 대장 길 이, 조직 손상 등을 개선 시키는 것으로 나타났다. 또한, RAW 264.7 cell 세포에 리보플라빈의 처리는 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-6와 같은 염증성 cytokine, NO의 생성 및 iNOS 단백질 발현을 억제하는 효과가 있음을 나타내었 다. 이상의 결과로 미루어 보아 리보플라빈은 염증성 대장염 에 예방효과가 있을 것으로 사료되며, 기능성 소재로 개발하 는데 기초자료로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.