I. 서 론
우리나라를 비롯한 전 세계에서는 급격한 인구 노령화로 인해 질병 없이 건강하게 노후를 맞이하고자 하는 욕구가 증 가하고 있다. 또한 현대인의 식생활 습관, 생활방식 등의 변 화 등으로 인해 당 섭취가 증가하고 있으며, 이에 따라 대사 성 증후군과 같은 만성질환의 위험도가 높아지고 있다. 대표 적인 대사증후군으로는 고혈압, 고중성지방혈증, 비만, 당뇨 병, 허혈 심장질환 등이 있다(Wang et al. 2020).
특히 당뇨병은 인슐린의 분비 및 기능 장애로 혈중 포도 당의 농도가 높아져 소변으로 포도당을 배출하게 되는 만성 대사성질환 중 하나이다. 당뇨병은 그 자체보다 당뇨 합병증 이 더 위험하여서 당뇨병 치료의 목적은 주로 당뇨합병증의 유발이나 진행을 억제하는 데 있다. 대표적인 당뇨 합병증으 로는 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증, 당뇨병성 동맥경화 등 이 있다(Ghaderian et al. 2015).
체내에 혈당이 높아진 상태가 지속되면 체내에 당화 반응 으로 최종당화산물(Advanced glycation endproducts, AGEs) 이라는 화합물이 생성되게 되며, 또한 외부의 최종당화산물 이 많은 음식이나 식품의 섭취로도 축적되게 된다. 최종당화 산물 당독소로도 알려져 있으며, 당뇨합병증의 여러 원인 중 하나로 알려져 있다(Park et al. 2014).
최종당화산물 생성 원리를 살펴보면 식품 중 환원당의 카 보닐 그룹과 단백질 내 아미노산의 비효소적 반응인 마이야 르(Millard) 반응을 통하여 형성되며(glycation), 인체 내에서 정상적인 신진대사 과정과 섭취하는 음식물의 조리과정에서 모두 발생한다. 당과 아미노산은 비효소적인 반응인 마이야 르 반응이 일어나 쉬프염기(Schiff base)를 생성한 후 재배열 되어 아마도리(amadori)형의 초기 당화산물(early glycation products)을 생성되는데 이 반응은 가역적으로 일어난다. 그 러나 고혈당이 지속되면 아마도리형 초기 당화 산물이 분해 되지 않고 재배열되고 콜라겐(collagen)과 같은 단백질과 교 차결합(cross-linking)하여 비가역적인, 즉 분해되지 않은 최 종당화산물(late glycation products)이 생성된다(Bucala et al. 1995). 이렇게 생성된 최종당화산물은 한번 생성되면 분 해되기가 어렵고 모든 부위에서 일어나게 되어 정상혈당으 로 회복되어도 분해되지 않고 혈액 주요 단백질이나 여러 조 직에 결합하여 장기 손상을 유발한다(Huebschman et al. 2006). 또한 최근 보고에 의하면 형성된 최종당화산물은 각 세포 내 최종당화산물 수용체라 불리는 Receptor for Advanced glycation endproducts (RAGE) 수용체와 결합하여 활성산소 (Reactive oxygen species, ROS) 생성으로 세포 손상을 일 으키고 이러한 ROS는 또한 최종당화산물 생성을 가속한다 (Chen et al. 2016).
메틸글라이옥살(Methylglyoxal, MGO)은 포도당 대사 과 정 중에서 생성되는 매우 반응성이 좋은 카보닐기(α-dicarbonyl) 대사체로 세포 내의 단백질과 핵산과 반응하여 독성을 일으 키며(Murata-Kamiya & Kamiya 2001), 최종당화산물의 전 구물질로서 활성산소(ROS) 기전, 염증 기전 등의 하위 신호 에 영향을 미쳐 세포 및 조직에서 독성을 일으키는 물질이 다(Maessen et al. 2015). 메틸글라이옥살을 조절하는 효소는 글라이옥살레이즈(glyoxalase, GO)로서 메틸글라이옥살의 형 성을 억제하여 하위 기전인 산화에 따른 스트레스를 조절한 다. 메틸글라이옥살에 의한 세포독성을 억제하는 물질도 당 뇨합병증 예방제와 치료제로서 역할을 할 수 있다. 또한 최 종당화산물을 저해하는 여러 가지 단계 중에 최종당화산물 의 생성(formation), 교차결합(cross-linking)억제(inhibition)에 사용되는 아미노구아니딘 (aminoguanidine (AG))은 당뇨병 동물 모델에 투여하였을 때 당뇨병성 합병증을 완화하며 최 종당화산물 생성을 억제한다고 보고되어 있으나 임상실험 결 과에서 독성이 나타나 개발이 중단되었다(Brownlee 1996).
ALT-711 (4,5-dimethyl-3-(2-oxo-2-phenacyl)-thiazolium chloride)는 thiazolium compound로부터 유래된 약물로 이미 형성된 최종당화산물 교차결합(cross-linking)을 절단(breaking) 하는 약물로 개발되었다. Streptozotocin (STZ) 유도 제1형 당뇨병 모델 쥐에 ALT-711을 투여하였을 때, 혈관과 신장 내 최종당화산물의 축적을 감소시켰다(Engelen et al. 2013). 그러므로 이러한 ALT-711은 최종당화산물 생성 억제제 (inhibition of formation)로서 이미 형성된 최종당화산물의 교차결합 억제제(cross-linking inhibition) 그리고 교차결합 절단제(cross-linking breaker)의 개발은 당뇨합병증을 예방하 거나 치료할 수 있는 새로운 접근일 수 있다. 그러나 아미노 구아니딘처럼 임상시험 독성을 나타낼 수 있어서 보다 천연 물이나 식품으로부터 유래된 안전하고 우수한 효능을 지닌 새로운 물질 개발이 시급히 요구되며, 최근에는 이러한 연구 가 활발히 진행되고 있다. 본 연구 그룹은 그동안의 연구를 통해 최종당화산물 억제제로 많이 알려진 phenolic compound 가 많이 함유된 두충, 형개, 정향 산자나무등을 연구한 바 있 다(Do et al. 2018a, Do et al. 2018b, Do et al. 2020, Lee et al. 2022).
호두나무(Juglans regia L.)는 가래나무과(Julandaceae) 속 하는 낙엽교목이다. 식용으로 사용되는 호두의 열매에는 약 60%의 오일을 함유하고 있으며, 비타민 등의 영양성분 뿐만 아니라(Kim et al. 2020), 불포화 지방산인 리놀레산(α- linolenic acid)과 리놀레산(linoleic acid)와 천연 항산화제로 알려진 알파코토페롤과 감마토코페롤 등을 함유하고 있다고 알려져 있으며, 쿼세틴등의 폴리페놀 물질이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다(Li et al. 2006). 호두 열매의 생리활성으 로는 항 알레르기, 항산화, 혈중지질억제 등이 보고된 바 있 으며(Seo et al. 2001, Kwak et al. 2014), 기호성 또한 좋 아 다양한 식품 제조에 널리 쓰이고 있다. 본 연구에서는 쥐 유래 신세뇨관 상피세포(kidney tubular epithelial), NRK- 52E 세포를 이용하여 호두 열매의 메틸글라이옥살 유도 신 장 독성 억제 효능을 확인하였고, 호두 열매 추출물이 최종 당화산물의 생성억제, 교차결합억제 그리고 이미 결합된 교 차결합을 절단하는 최종당화산물생성을 저해하는 효능을 지 니는지 확인하고자 하였다.
II. 연구 내용 및 방법
1. 재료 및 시약
본 실험에 사용한 시약은 Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin-streptomycin은 Gibco (Rockville, MD, USA)에서 구매하였고 fetal bovine serum (FBS)은 Highclone (Logan, UT)에서 구매하였다. 또한 Dimethylsulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Methylglyoxal (MGO), Aminoguanidine (AG), tetramethylbenzidine (TMB), bovine serum albumin (BSA), sodium azide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 실험에 이용하였다.
2. 호두 열매 추출물 제조
본 연구에 사용한 호두 열매(Juglans regia L)는 2019년 10월에 충청북도 영동군에서 재배된 것을 사용하였다. 겉껍 질 제거 후 파쇄하고 70% 주정(에탄올, 100 g/L)를 사용하여 50°C에서 3시간씩 2번 반복하여 추출하였다. 상등액 여과 후, 감압 농축 및 동결건조하여 제조된 고형 추출물(수율 3.8%) 을 −20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 이후 호두 열매 에탄올 주정 추출물을 결과에 JS로 표시하였다.
3. 세포배양
본 실험에 사용한 NRK-52E 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 10% heat-inactivated FBS이 첨가된 DMEM 배지(10 units/mL penicillin, 10 μg/ mL, streptomycin)를 이용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배 양하였다.
4. 세포 생존율 측정
NRK-52E 세포는 96-well 플레이트에 3×104 cells/well로 분주하여 세포 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 상등액 을 모두 제거하고 MGO 700 μM과 호두 열매 추출물을 각 각 50, 200 μg/mL 농도로 처리하여 추가로 24시간 동안 배 양하였다. 이후 MTT 시약 0.1 mg/mL을 첨가하여 3시간 동 안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양한 후 동량의 DMSO에 녹 여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 다 음과 같은 식을 사용하여 나타내었다.
5. In vitro에서 최종당화산물 생성 저해 효능
10 mg/mL의 BSA를 700 μL의 50 mM phosphate buffer 에 녹이고, 0.2M의 fructose와 glucose를 각각 100 μL씩 넣 었다. 또한 0.02% sodium azide를 넣어 반응 기간 동안 미 생물의 오염을 방지하였다. 이 혼합물에 호두 열매 추출물 또는 in vitro 표준 최종당화산물 생성억제제인 아미노구아니 딘을 200 μL 넣어 최종 1 mL이 되도록 한 후 37°C에서 14 일 동안 반응시켰다. 반응 14일 후 excitation 350 nm, emission 450 nm fluorescence analysis (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
6. 최종당화산물 교차결합억제 및 절단 효능 평가
최종당화산물 교차결합억제 및 절단 효능 평가에는 AGEBSA는 horseradish peroxidase (HRP) 라벨이 부착된 Kit- NH2 Unit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 최종당화산물 교차결합 억제 효능을 평 가하기 위해서 1.0 μg AGE-BSA와 아미노구아니딘 또는 호 두 열매 추출물을 콜라겐이 부착된 96-well microtiter 플레 이트에 분주한 후 37°C에서 18시간 동안 반응시켰다. 0.05% PBST에 3번 washing하고 TMB를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. AGE-BSA의 교차결합저 해(%)는 다음과 같이 계산하였다.
최종당화산물 교차결합절단 효능 평가는 1.0 μg AGE-BSA 를 콜라겐이 부착된 96-well microtiter 플레이트에 분주한 후 37°C에서 4시간 동안 반응하여 AGE-BSA와 콜라겐을 교차결합 시켰다. 0.05% PBST에 3번 워싱 한 후 교차결합 억제제로 알려진 약물인 ALT-711을 1 mg/mL 과 호두 열매 추출물을 각 well에 분주하고 18시간 반응시켰다. 이후 각 웰을 0.05% PBST로 3번 washing하고 TMB를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 다음과 같이 계산 하였다.
6. 통계분석
각 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였으며, GraphPad Prism5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) 를 이용하여 one-way ANOVA 시험법으로 통계 처리하였다.
III. 결과 및 고찰
1. 신세뇨관 상피세포 손상 억제 효능
신세뇨관 상피세포(renal tubular epithelial cell) 세포는 신 장에서 대부분 재흡수과정을 담당한다. 이러한 신세뇨관 상 피세포 세포주인 NRK-52E 세포에서 호두 열매 추출물의 신 장 세포 보호 효과를 확인하기 위하여 MGO유도 신장 독성 모델을 확립하였다. MGO는 최종당화산물의 전구체로 산화 에 따른 스트레스 및 염증 반응을 유발하고 당과 지질대사 에 이상을 초래하여 반응성이 강한 카르보닐기 화합물을 생 성하게 된다. 이로 인해 최종당화 산물의 생성을 촉진하게 된다(Sena et al. 2012). 메틸글라이옥살 0-1,000 μM로 농도 범위를 설정한 뒤 MTT assay를 통하여 세포 생존율이 50- 70%가 되는 농도 700 μM을 설정하였다. NRK-52E 세포에 호두 열매 추출물 50, 200 μg/mL과 MGO 700 μM을 동시 에 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과 메틸글라이옥살 처 리 군(MGO)에서는 60%의 세포 생존율을 나타내었고, 호두 열매 추출물(50, 200 μg/mL)와 메틸글라이옥살을 동시에 처 리하였을 때 각각 75, 88%의 세포 생존율을 나타내었다. 신 세뇨관 상피세포에서는 Na+-K+ ATPase 펌프를 이용하여 Na+ 이온을 간질액으로 수송하는데 이 이온들은 모세혈관을 통해 재 흡수된다. 정상적인 혈중 포도당 및 아미노산 범위 에서 포도당과 아미노산은 100% 재 흡수되지만 혈중 포도 당 농도가 일정 범위 이상으로 높아져 재흡수 용량을 초과 하게 되면 소변에서 포도당이 검출되게 되어 당뇨병이 발생 하게 된다(Carlström et al. 2015). 또한 신세뇨관 상피세포는 염증세포의 유입에 직접 관여할 수 있어 여러 자극으로 대 식세포, T림프구 등의 염증 세포를 유입시킬 수 있는 여러 가지 화학주성반응 인자를 분비할 수 있으며 또한 ICAM-1, VCAM-1 등 부착물질들의 발현을 증가시킬 수 있다(Han et al. 2018). 그러므로 신세뇨관 상피세포의 손상을 억제하는 것은 신장 세포 및 조직의 기능을 유지하는 데 도움이 된다 고 할 수 있다. 본 연구에서는 호두 열매 추출물이 최종당화 산물 전구물질이며 신장 독성을 일으키는 메틸글라이옥살 유 도 세포 모델에서 세포 손상을 억제함으로써 신장 세포 보 호 효과를 나타낸다고 할 수 있다<Figure 1>.
2. 최종당화산물 생성(Formation) 억제 효능 평가
고혈당으로 인해 축적되는 최종당화산물은 당뇨병 환자에 서 정상인보다 수배 이상 함량이 증가하는 것으로 연구되어 있으며 당뇨합병증의 발병 원인으로 알려져 있다. 최근의 연 구로부터 당뇨합병증과 관련하여 천연물 및 식품소재로부터 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하는 다양한 소재가 개발되고 있다. 호두 열매의 70% 주정 추출물의 최종당화산 물 생성억제를 glucose와 fructose를 이용하여 효능 평가를 시행하였다. 최종당화산물 생성능을 100% (AGE)로 나타내 었을 경우 양성대조군 아미노구아니딘을 1 mM 처리한 대조 군(control)에서는 77%의 최종당화산물 생성억제효능을 나타 내었으며 호두 열매 추출물 50, 200 μg/mL 농도에서 각각 95, 100%의 최종당화산물 생성억제효능을 나타내어 양성대 조군보다 우수한 효능을 확인하였다. 이 결과를 통해 호두 열매 추출물이 glucose와 fructose에 의해 BSA가 당화되는 반응을 억제할 수 있음을 확인하였고 이는 당뇨병 환자에서 관찰되는 혈당 범위에서 최종당화산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다. 최종당화산물의 생성 원인에 산화에 따른 스트레스에 의해 최종당화산물의 생성이 가속된다고 알려져 있어(Moldogazieva et al. 2019) 추후, 호두 열매 소재의 항 산화 효능에 대해서도 검증해 볼 필요가 있다<Figrue 2>.
3. 호두 열매 추출물의 최종당화산물의 콜라겐 교차결합 억제 효능 평가(Cross-linking inhibition)
당과 아미노산은 비효소적인 반응인 마이야르 반응이 일 어나 쉬프염기를 생성한 후 재배열되어 아마도리형의 초기 당화산물(early glycation products)을 생성되는데 이 반응은 가역적으로 일어난다. 그러나 지속적인 고혈당 상태는 초기 당화산물이 분해되지 않고 체내에서 재배열되고 콜라겐, 파 이브로넥틴(fibronectin)과 같은 단백질과 교차결합 하여 분 해되지 않고 축적되게 된다. 본 연구에서는 호두 열매 추출 물이 최종당화산물과 콜라겐 단백질과 비가역적 교차결합 억 제 효능을 확인하기 위하여 최종당화산물 교차결합의 억제 효능을 평가하였다. 최종당화산물 교차결합 억제제로 알려진 양성대조군인 아미노구아니딘은 교차결합 억제 효율이 1 mM 에서 67%로 나타났다. 호두 열매 추출물을 50, 200 μg/mL 로 처리한 군에서는 교차결합 억제가 각각 54, 99%로 최종 당화산물의 교차결합을 억제하였으며, 특히 저농도에서 효능 이 있음을 확인하였다. Brandt 그룹에서는 당뇨병 환자 중에 각막의 두께가 증가하여 있음을 연구하였고 아미노구아니딘 이 막 콜라겐 단백질의 교차결합억제에 효능이 있음을 확인 하였다(Brandt et al. 2001). 고혈당은 glycation을 통하여 각 막 기질 내의 콜라겐 교차결합을 유도한다고 알려져 있다. 이는 최종당화산물이 당뇨합병증 중 당뇨병성 망막합병증을 일으키며 이를 조절하여 당뇨합병증을 조절할 수 있음을 나 타낸다<Figure 3>.
4. 호두 열매 추출물의 최종당화산물 교차결합 절단 효능 평 가(cross-linking breaker)
In vitro, in vivo에서 최종당화산물은 콜라겐, 라미닌 (laminin), 피브로넥틴과 같이 수명이 긴 기질 단백질과 비가 역적인 교차결합을 한다. 정상적인 콜라겐 교차결합은 아미 노기와 카르복실기 말단의 특정적인 부위에서 일어난다고 알 려졌지만, 최종당화산물에 의한 콜라겐의 교차결합은 모든 부위에서 무작위적으로 일어난다. 비정상적인 교차결합은 조 직에 변화를 주고 기능을 상실시킨다(Edelstein & Brownlee 1992). 본 연구에서는 호두 열매의 최종당화산물과 콜라겐사 이에 이미 형성된 글라이코알데하이드(glycoaldehyde)과 같 은 비가역적 교차결합을 절단하는 효능을 확인한 결과, 200 μg/mL의 호두 열매 추출물을 처리하였을 때 9.73%의 교차 결합 제 효능을 나타내었다. 최종당화산물 절단 약물로 알려 진 양성대조군 ALT-711은 1 mg/mL 처리하였을 때 22% 절 단 효능을 확인하여 고농도에서는 양성대조군보다 더 효능 이 우수함을 확인하였다. 기존 연구에 의하면 천연물 및 식 품소재의 페놀릭 화합물이 항산화 효능과 더불어 최종당화 산물 억제 효능을 나타낸 연구가 많이 진행되고 있어 본 연 구에서도 추후 호두 열매 추출물에 존재하는 페놀릭 화합물 및 그 외 어떠한 성분이 최종당화산물의 교차결합을 억제하 는지에 대한 평가가 필요하다고 생각한다<Figure 4>.
IV. 요약 및 결론
가래나무과(Julandaceae) 속하는 낙엽교목인 호두나무 (Juglans regia L.)의 호두 열매의 메틸글라옥살 유도 신장 세포의 독성 억제 활성을 검토하고, 당뇨합병증 및 다양한 질병의 원인이라고 알려진 최종당화산물(Advanced glycation endproducts, AGEs)의 생성, 생성된 최종당화산물의 생성억 제, 교차결합 억제 그리고 이미 결합된 교차결합을 절단하여 최종당화산물을 억제하는 효능을 측정하였다. 호두 열매 70% 주정 추출물은 메틸글라이옥살로 유도한 NRK-52E 신세뇨 관 상피세포의 세포독성을 억제하여 75.88%의 세포생존율을 나타내었다. 이는 신세뇨관 상피세포의 기능저하를 억제할 수 있음을 시사한다. 최종당화산물의 형성 세가지 단계에서 호두 열매 추출물(50, 200 μg/mL)의 최종당화산물 생성 조 절에 관여하는지 확인하였다. 그 결과, 최종당화산물의 억제 효능은 95, 100%로 양성대조군인 아미노구아니딘은 77%의 억제율보다 우수하였다. 또한 이미 형성된 최종당화산물은 체내 콜라겐 단백질과의 결합을 통해 조직 및 세포의 이상 을 나타내는데 호두 열매 추출물은 이러한 콜라겐 단백질과 의 교차결합을 억제하거나 이미 형성된 교차결합을 절단하 는 효능을 확인 할 수 있다. 호두 열매 추출물을 50, 200 μg/mL을 처리하였을 때 교차결합 억제는 54, 99%로 양성대 조군인 아미노구아니딘보다 우수한 효능을 나타내었고, 절단 효능에서는 200 μg/mL의 호두 열매 추출물을 처리하였을 때, 절단효능이 9.73%로 양성대조군으로 알려져 있는 ALT-711 (1 mg/mL)의 22%보다 우수한 효능이 있음을 확인하였다. 이 상의 결과를 종합해 보면, 주정 70% 호두 열매 추출물은 당 뇨합병증 및 주요질병의 원인이라고 알려져 있는 최종당화 산물의 생성 기작을 조절함으로서 최종당화산물과 관련된 다 양한 질병을 예방하거나 치료할 수 있을 것으로 생각된다. 호두 열매 추출물에는 많은 페놀성분이 함유되어 있어, 항균, 항산화, 항암 활성을 나타낸다고 알려져 있 많은 그룹의 선 행연구에서 인지기능, 항산화기능등의 건강기능성 관련 효능 연구가 활발히 진행되었다. 특히 Juglone이라는 성분은 가래 나무과에 많이 함유되어 있는 페놀성분으로 항생 방부 그리 고 항산화효과가 우수하다고 알려져 있다(Ahmad & Suzuki 2019). 추후 Juglon을 비롯한 호두 추출물의 단일화합물에 대 한 효능 검증 및 최종당화산물의 생성기작에 대한 효능 검 증이 필요할 것으로 생각되며, 더 나아가 메틸글라이옥살 유 도 세포모델에서의 추가적인 기전 연구와 더불어 in vivo 실 험을 통해서 안전한 당뇨합병증 예방 및 치료제 검증이 필 요할 것으로 생각된다.
