I. 서 론

혈관에 칼슘이 축적되어 딱딱하게 굳어지는 혈관 석회화 는(vascular calcification) 동맥경화, 당뇨, 만성신부전 환자에 서 흔히 발생한다. 최근 심혈관 질환 예방에 대한 관심이 높 아지면서, 지용성 비타민 K 섭취의 중요성이 부각되고 있다. 천연물 소재의 혈관석회화의 치료를 위한 항산화제에 대한 연구로, 10-dehydrogingerdione (10-DHGD), apocynin, curcumin, diosgenin, ellagic acid, gallic acid, gingko biloba extracts, puerarin, quercetin, resveratrol, silybin, and vitamin E에 대한 in vitro와 in vivo 실험 결과가 보고된 바 있다(Chao et al. 2019).

시금치(Spinacia oleracea L.)는 우리나라에서는 1500년대 부터 이용되고 있는 대표 식재료로, 비타민 A의 전구체인 카 로틴과 비타민 C, 칼슘, 철분 등의 무기질을 다량 함유하고 있으며, 비타민 K와 클로로필을 포함하고 있는 녹황색 엽채 류이다(Kim et al. 1993;Lee et al. 2005).

비타민 K는 혈액응고 및 골 대사 기능을 가지며 시금치, 브로콜리, 상추와 같은 녹색 채소에 다량 존재하는 비타민 K1 (필로퀴논; Phylloquionone)과 동물성인 고기, 치즈, 유제 품, 달걀 등에 존재하거나 미생물에 의해 합성되는 비타민 K2 (메나퀴논; Menaquinones, MKs)의 두 개 형태로 존재한 다(Terhi et al. 1997;Schurgers & Vermeer 2000).

비타민 K2인 메나퀴논은 옆 사슬의 길이에 따라 MK-n으 로 표기하며, n은 옆 사슬의 아이소프레노이드(isoprenoid: 이 소프렌 구성단위)의 수로 메나퀴논-4, 5, 7, 13 (menaquinone- 4, 5, 7, 13; MK-4, MK-5, MK-7, MK-13) 등으로 구분되 며 긴 사슬은 낫토, 청국장 등의 발효음식에서 확인된다 (Walther et al. 2013). 비타민 K2의 체내 이용률은 비타민 K1 보다 더 높으며, 메나퀴논의 MK-4, MK-7, MK-8과 MK-9은 심혈관계 질환을 예방하는 기능이 알려져 있다(Cui et al. 2018;Hariri et al. 2021). 이전 연구에 따르면, 비타 민 K2를 30 mcg 이상 꾸준히 섭취한 사람은 관상동맥 석회 화 위험을 52% 낮추며, 심혈관 질환으로 사망할 확률이 57% 낮아졌다는 보고가 있다(Geleijnese et al. 2004).

유산균 (Lactic acid bacteria; LAB)은 발효 식품에서 비 타민 생산자로서의 중요한 열쇠로, Lactococcus lactics, Leuconostoc lactics, Leuconostoc mesenteroides는 다량의 MK-7부터 MK-9의 생산자로 알려져 있으며, 이 중 특히 Lactococcus lactics와 Lactococcus ceremoris 는 MK-3부터 MK-10를 생산한다(Morishita et al. 1999;Liu et al. 2019).

그러므로, 본 연구에서는 세포 밖 대동맥 고리에서 무기인 산염(inorganic phosphate: PI)에 의해 유도된 혈관 석회화 모델에서 새로운 소재인 시금치 착즙액에 Lactococcus lactics와 Leuconostoc mesenteroides 유산균을 공배양하여 비타민 K2를 증대시킨 발효 시금치 추출물(Fermented Spanish Extracts: FSE)로부터 혈관 석회화 저하 효능을 구 명하고자 하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 연구재료

무기인산염(PI: NaH₂PO₄, Na₂ HPO₄), Rapamycin는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 조직배양 배지로 사용된 Dulbecco’s modified Eagel’s medium/F12K (DMEM/F12K)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS) 및 항생제(antibioticantimycotic solution)는 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 웨 스턴 블롯 분석을 위한 단백질분해효소 및 포스파타아제 저 해제는 Thermo Scientific (Waltham, USA) 제품을 사용하 였고, 일차 항체 runt-related transcription factor 2 (Runx2), bone morphogenetic protein-2 (BMP2), phosphor-ERK, ERK, phosphor-p38, p38, β-actin은 Abcam (Cambridge, Massachusetts, US)에서 구입하였으며, 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

2. 발효 시금치 추출물 제조

시금치는 2019년 경상북도 영천에서 생산하고 시금치를 10 kg 구입하여 깨끗한 물로 고압 살포하여 세척 후 착즙기 를 이용하여 파쇄와 동시에 압착하여 찌꺼기는 버리고, 착즙 액은 18.5 kg을 얻었다. 시금치 착즙액을 발효 원료로 사용 하여 유산균 발효물을 제조하기 위해, 2018년 6월 경북수산 자원연구원의 양식장 해수에서 분리 및 동정 된 Lactococcus lactics (Ll)와 Leuconostoc mesenteroides (Lm)를 이용하였 다. 유산균 2종의 16S rRNA 분석 후, 한국미생물보존센터 에 기탁되었으며, 수탁번호는 Lactococcus lactics (KCCM 12759P)와 Leuconostoc mesenteroides (KCCM 12756P)이다.

시금치 착즙액 200 mL에 L. lactics (KCCM 12759P), L. mesenteroides (KCCM 12756P)을 각각 1×10⁸ cfu/mL 농도 로 0.2 mL (1%; v/v)씩 접종하고 26°C에서 24시간 동안 배 양하였다. 유산균을 접종한 시금치 착즙액을 원심분리기 (Hanil, Daejeon, Korea)로 원심분리하여, 시금치 발효물 등 이 포함된 잔여물을 PBS 버퍼로 2번 정도 세정하고 lysozyme (10 mg/mL; Roche, USA)을 포함하는 6 mL의 PBS를 넣고 37°C에서 1시간 동안 방치 후, 볼텍스(Scientific Industries, Newyork, USA)로 vortexing 한다. 그 후 상온에서 25mL 추출 버퍼(99 (v/v)% n-hexane: 99 (v/v)% isopropanol =2:1; v/v)를 더하고 30초 동안 볼텍스로 혼합한 후 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 얻는다. 상등액 을 모으고 남은 아래에 25 mL isopropanol을 첨가하여 30초 동안 볼텍스로 혼합한 후 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분 리하여 상등액을 얻고, 이같은 추출과정을 반복하여 총 75 mL의 상등액을 진공 농축 후 생체 밖 실험을 위해서는 DMSO로 용해하여 FSE 시료를 준비하였다. FSE 50 μg/mL 시료에는 비타민 K2는 10.5 pg/mL정도가 포함되어 있다.

3. 비타민 K1과 K2 정량

비타민 K1과 K2 분석을 위해 high performance liquid chromatography (HPLC, Shimazu Prominence HPLC system, Japan)와 mass spectrometry (MS, API 5500 QTRAP mass spectrometry; AB SCIEX, USA)를 이용해 비타민 K1과 비 타민 K2, 즉 MK-4, MK-7 및 MK-9을 정량 분석을 수행하 였다. 구체적으로, HPLC용 컬럼 Kinetex C18 column (2.1 ×50 mm, 2.6 μm; Phenomenex, USA)를 사용하였고, mass spectrometry (API 5500 QTRAP; AB SCIEX)를 사용하였 다. 이동상 용액의 경우 이동상 A 용액인 0.1% 폼산 (Formic acid; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포 함하는 5mM 폼산암모늄(Ammonium formate, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 99 (v/v)% 메탄올(methanol) 과 이동상 B 용액인 99 (v/v)% 이소프로판올과 99 (v/v)% 메탄올 혼합물(isopropanol:hexane=9:1, v/v)을 6:4 (20초), 0:10 (5분), 6:4 (8분) 부피비로 혼합하여 사용하였다. 컬럼 의 온도는 60°C로 0.5 mL/min으로 유지하였으며, 시료는 50 μL 주입하였다. 비타민 K1 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO,)과 비타민 K2의 MK-4, MK-7, 그리고 MK-9 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 표준 물질을 이용해 각각의 비타민 K1 (MW 450.7 g/mol; C₃₁H₄₆O₂)과 비타민 K2, 즉 MK-4 (MW 444.6 g/mol; C₃₁H₄₀O₂), MK-7 (MW 649.7 g/mol; C₄₆H₆₄O₂), MK-9 (MW 785.2 g/mol; C₅₆H₈₀O₂)의 표준 값을 얻었고, 얻은 표준 값과 시료 값을 대비하여 얻은 무게 값을 정량 하였다.

4. 생체 밖 혈관 석회화(ex vivo calcification)

체중 20-22 g 내외의 C57BL/6 생쥐를 오리엔트(Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. 실험 동물은 온도 21±2°C; 습도 50-60%; 12시간 주기 명/암 하에서 일반고형사료와 물을 충 분히 공급하면서 1주 동안 사육실 적응을 완료한 후 실험에 사용하였고, 모든 실험은 한국식품연구원 동물윤리위원회의 윤리 규정에 의거하여 실시하였다. 한국식품연구원의 동물윤 리위원회의 승인 번호는 KFRI-M-21026이다. 혈관 석회화 모델을 구축하기 위하여 C57BL/6의 내림 대동맥을 절취한 후 대동맥 주의의 지방을 제거하였다. 내림대동맥에서 대동 맥고리를 3-5 mm 크기로 자른 후 자른 조직을 10% FBS와 DMEM/F12K 배지가 담긴 12 well plat에 넣었다. PI로 혈 관석회화를 유도하기 위해 NaH₂PO₄와 Na₂HPO₄을 1:1 혼 합하여 1.4 mM PI, 2.6 mM PI군으로 골형성 배지를 만든 후 Cont, PI 1.4 mM, PI 2.6 mM군으로 나눈 후 5% CO₂ 및 37°C의 조건으로 배양기에서 배양하였다. 또한, Cont, PI 2.6 mM, PI 2.6 mM+Rapamycin 100 ng/mL (Pi 2.6 mM +Rapa), PI 2.6 mM+FSE 100 μg/mL (Pi 2.6 mM+FSE)군 으로 나누어 각각의 시료를 처리 후 조직을 넣은 후 5% CO2 및 37°C의 조건으로 배양기에서 배양하였다. 2-3일마다 배양액을 교체 해주고 넣은 다음 7일 후에 염색 및 단백질 발현 측정을 실시하였다.

5. 면역조직염색법

혈관 석회화 배양액에서 꺼낸 대동맥 고리 조직을 4% 포 르말린(Biosesang, Seongnam, Korea)에서 24시간 고정한 후 파라핀에 묻은 후 5 μm 크기로 자른다. H&E염색약(Nanjing Jiancheng, China)으로 염색 하였다. 슬라이드 위에서 염색된 부위의 다섯 곳을 선택 한 후 현미경(Nikon Eclipse Ti confocal microscope, Tokyo, Japan)으로 사진을 찍었다.

6. 혈관 석회화 측정

대동맥 벽안에 형성된 칼슘 축적된 것을 측정하기 위해 Alizarin red 염색(calcium)과 von kossa (calcium과 phosphate) 염색을 kit를 활용하여 실시하였다. Alizarin red 염색(EMD Millipore, USA)은 제공한 실험방법대로 따라하였다. 간단히 설명하면, 슬라이드 위의 조직을 탈파라핀화 하기 위해 알코 올로 여러 번 씻은 후 자이랜을 처리 후 다시 물로 세척하였 다. 1% ARS 용액을 5분 처리 후 acetone을 처리하였다. 물 로 세척 후 mounting 용액으로 고정 후 밀봉하였다. 다음으 로 Von Kossa staining kit (Abcam, USA)를 사용하여 제 공된 실험방법대로 염색을 하였다. 슬라이드위의 조직을 탈 파라핀화 하기 위해 알코올로 여러 번 씻은 후 자이랜으로 처리 후 다시 물로 세척하였다. Silver nitrate로 염색 후 UV 램프에 1시간 놓아 둔 후 물로 세번 세척하였다. 이 후 2.5% 소듐 치오설페이트를 5분간 처리 후 물로 세척하고 red fast 염색약으로 핵을 염색 세척, mounting 용액으로 고정 후 밀봉하였다. 슬라이드 위에서 염색된 부위의 다섯 곳을 선택 한 후 현미경(Nikon Eclipse Ti confocal microscope, Tokyo, Japan)으로 사진을 찍은 후 혈관 석회화 부분을 정상군대비 하여 %로 나타내었다.

7. 단백질 발현 측정

대동맥 내 단백질 발현 변화를 측정하기 위하여 웨스턴 블 롯 분석을 수행하였다. 석회화를 유도한 후 7일 경과 후 얻 은 대동맥에 단백질추출용액(Elpis biotech, Daejeon, Korea) 을 bead와 같이 첨가하여 용해시킨 후 조직분쇄기에 넣고 4°C, 10,000 rpm, 5 min간 돌린 후 다시 13,000 rpm 원심분 리기로 10분간 원심분리기로 돌린 후 상등액을 걷어 내었다. 단백질 정량 후 30 μg의 단백질을 4-15% SDS-PAGE로 20 mA에 1시간 동안 전기영동 하였다. 이후 전기영동 된 단백 질을 80 V에서 1시간 30분 동안 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 이동하였으며, 5% 탈지 분유를 사용 하여 실온에서 1시간 동안 블로킹 시켰다. 1차 항체들은 1:500-1000 농도로 4°C, overnight 조건으로 반응시킨 다음, TBST로 10 분간 3회 세척 후, 이차 항체들은 1:3000-5000 농도로 실온에서 1시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척 후 enhanced chemoluminescence (ECL) reagent (LI-COR, Lincoln, NE, USA)로 발색 시켰으며, ChemiDoc 기기(Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질 밴드 발현도를 측정하였다.

8. 통계처리

모든 측정값은 평균값±표준 오차 평균(mean±SD)으로 표 시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Graph pad 8.0 program를 이용하였다. 각 집단간 행동 측정치의 one-way ANOVA를 시행하였고, 사후 검정은 Tukey test를 적용하였 다. 전체 실험의 통계적인 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의 미를 부여하였다.

III. 결과 및 고찰

1. 발효 시금치 추출물의 비타민 K1과 K2 함량

MRS (대조군)과 시금치 착즙액에 L. lactics와 L. mesenteroides 을 각각 1×10⁸ cfu/mL 농도로 26°C에서 24시간 동안 배양 후의 LAB (Lactic Acid Bacteria) 수(log cfu/mL)를 측정하 여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였다. 그 결과, MRS 배 지에 L. lactics와 L. mesenteroides 두 종을 공발효한 경우 2.14×10¹⁰/mL로 측정되었으며, 시금치 착즙액에 L. lactics와 mesenteroides두 종을 공발효한 경우는 2.50×10¹¹/mL로 측정 되었다. 결과적으로, 시금치 착즙액 배지에 L. lactics와 L. mesenteroides로 공배양 한 군에서 유산균 성장이 대조군 보 다 높았다.

지용성 비타민인 K1과 K2 추출 용매 최적화를 위해 헥산, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올로 추출물을 확인한 결과, 이소 프로판올 용매 추출에서 비타민 K1과 K2, 즉 MK-4, MK-7 및 MK-9 생성량이 가장 높은 것을 확인하였다(data not shown). 그 결과, MRS 내 비타민 K1은 472.82±1.63 μg/ 100 g로 측정되었으며, 비타민 K2는 생성되지 않았다. 시금 치 착즙액에 L. lactics 및 L. mesenterodes 유산균을 공배양 하여 이소프로판올로 추출한 FSE 내 비타민 K1은 601.15 ±2.21 μg/100 g, 비타민 K2의 MK-4는 16.48.15±0.11 μg/ 100 g, MK-7은 3.87±0.04 μg/100 g, MK-9는 0.75±0.01 μg/ 100 g로 측정되어 L. lactics 및 L. mesenterodes 유산균으로 공배양을 한 경우 비타민 K2 즉, MK-4, MK-7, MK-9가 생성된 것을 확인하였다. 이전 문헌에서처럼 유산균의 특정 종들인 Lactococcus lactics spp. lactics, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactics 및 Leuconostoc mesenteroides 은 비타민 K2 생산자임을 확인 할 수 있었다 (Morishita et al. 1999;Liu et al. 2019).

2. 무기인산염의 농도에 따른 생체 밖 혈관 석회화 유도

PI의 처치는 평활근세포와 세포 밖 대동맥고리에서 혈관석 회화를 유도한다고 알려져 있다(Gao et al. 2020). 이에 PI가 포함된 골형성 배지에 대동맥 고리를 넣어 혈관석회화를 측 정해 보고자 하였다. Cont, PI 1.4 mM, PI 2.6 mM로 군을 나누었다. 대동맥고리의 형태학적 변화 및 혈관 석회화 변화 양상을 확인하기 위하여 HE염색, ARS, von kossa염색을 실 시하였다. ARS는 칼슘 축적을 측정하는 것이고, von kossa 는 칼숨과 인의 축적에 의한 무기질화 정도를 측정하는 마 커로 사용된다. <Figure 1>에서 보는 것과 같이 Cont군에서 는 ARS와 von kossa염색에 의해 거의 발색 되지 않았다. 그러나 PI농도에 의해 ARS와 von Kossa 염색이 각각 붉은 색 그리고 검은 색으로 발색 되는 것을 관찰할 수 있었다. PI 2.6 mM에서 혈관 석회화가 유의성 있게 유도되어 추후 실험 시 이 농도를 사용하고자 한다. 이상의 결과로 미루어 보아 PI는 대동맥고리에서 혈관석회화를 유도한다는 것을 확 인할 수 있었다.

3. FSE의 PI에 의해 유도된 생체 밖 대동맥 고리에서의 혈관 석회화 저해 효능

비타민 K2는 평활근 세포 및 대동맥고리에서 혈관 석회화 를 저해 효과가 있다고 보고 되었다(Qiu et al. 2017). 비타 민 K2의 함량을 증대시킨 FSE가 PI에 의해 유도된 혈관 석 회화를 조절할 수 있는지 보고자 하였다. 이전 연구에서 FSE 가 사람의 탯줄 동맥 혈관내피세포에서 LPS에 의해 유도된 염증을 억제한다고 보고하였다(Lee et al. 2022). 위의 연구 에서 발효 시금치 추출물 200, 400 μg/mL에서 세포 독성이 나타나지 않았다. 본 연구는 혈관내피세포, 평활근세포가 포 함되어 있는 대동맥으로 실험을 진행하는 것으로 혈관 내피 세포에서 세포 독성이 나타나지 않지만, 7일 이상 배양을 해 야하는 것을 고려하여 FSE는 50 μg/mL으로 농도를 정하여 실험을 진행하였다. Cont, PI 2.6 mM, PI+Rapamycin (Ra), PI+FSE군으로 나눈 후 골형성 배지에 대동맥 고리를 넣은 후 각군의 약물을 처리한 후 7일 후 결과를 관찰하였다. 그 결과 <Figure 2>에서 보는 것과 같이 Cont군에 비해 PI 군 에서 ARS와 von kossa 염색이 각각 붉은색 그리고 검은색 으로 발색 되는 것을 관찰할 수 있다. 그러나 FSE를 같이 처치한 군에서는 이들의 발색이 유의하게 감소하는 것을 관 찰할 수 있으며, 양성억제제로 Ra 10 nM을 처리한 군에서도 ARS와 von kossa염색이 유의하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 미루어 볼 때 FSE는 혈관 석회화를 저해하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

4. FSE의 PI에 의해 유도된 생체 밖 대동맥 고리에서의 골형 성 단백질 저해 효능

골분화(osteogenic differentiation)와 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cell)의 섬유화 과정은 닮아 있다. 평활근 세포는 무기인산염 등에 의해 본래의 세포 형태 (contractile type)에서 골형성 형태(osteogenic type)로 변하면 서 골형성 유전자인 Runx2, BMP-2발현이 증가된다고 보고 되었다(Akiyoshi et al. 2016;Gao et al. 2020). 이에 본 연구에서 FSE가 PI에 의해 유도된 골형성 단백질을 조절할 수 있는지 보고자 하였다. Cont, PI, PI+Ra, PI+FSE 군으로 나눈 후 골형성 배지에 대동맥 고리를 넣은 후 각 군의 약물 을 처리한 후 7일 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿을 활 용하여 변화양상을 관찰하였다. 그 결과 <Figure 3>에서 보 는 것과 같이 Cont군에 비해 PI 군에서 Runx2와 BMP-2 단백질 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, FSE를 같이 처치한 군에서는 이들의 발현이 유의하 게 감소하는 것을 관찰할 수 있으며, 양성억제제로 Ra를 처 리한 군에서도 Runx2와 BMP-2 단백질 발현이 유의하게 감 소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, FSE는 골형성을 저해하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

5. FSE의 PI에 의해 유도된 생체 밖 대동맥 고리에서의 MAPK 키나아제 활성 저해 효능

ERK/MAKP 신호 전달 기전은 조골세포 분화를 촉진하는 Runx2와 같은 골형성변이를 위한 중요한 조절인자이다 (Ding et al. 2006;Feng et al. 2016;Park et al. 2020). FSE의 골형성 기전을 알아보고자 골분화에 관여하는 인자인 MAPK키나아제의 인산화를 측정하고자 하였다. Cont, PI, PI+Ra, PI+FSE군으로 나눈 후 골형성 배지에 대동맥 고리를 넣은 후 각군의 약물을 처리한 후 7일 후 단백질을 추출하 여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과 <Figure 4>에서 보는 것과 같이 Cont군에 비해 PI 군에서 p-ERK와 p-p38단백질 발현이 유의하게 증가 하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 FSE를 같이 처치한 군에서는 이들의 발현이 유의하게 감소 하는 것을 관찰할 수 있으며, 양성억제제로 Ra을 처리한 군 에서도 p-ERK와 p-p38단백질 발현이 유의하게 감소되는 것 을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, FSE는 MAPK 키나아제 중 ERK와 p38의 인산화 활성을 통해 혈관 석회화를 저해하는 효과를 나타낼 것으로 사료된다.

IV. 요약 및 결론

본 연구에서는 발효 시금치 추출물(FSE)의 혈관 석회화 저 해 효과를 확인하기 위해, 세포 밖 대동맥 고리에서 무기인 산염에 의한 혈관 석회화를 억제하는 효능이 있음을 확인하 고자 하였다. FSE는 시금치 착즙액보다 vitamin K1의 양이 증가되었으며, 특히 vitamin K2는 발효에 의해 생성되었음 을 확인하였다. PI를 대동맥 고리에 처리하여 혈관 석회화를 유도 시 농도 별로 칼슘 축적 및 무기질화되는 것을 확인하 였다. FSE는 PI에 의해 유도된 혈관 석회화의 칼슘 축적 및 무기질화를 억제 시키는 것을 확인하였다. 또한, FSE는 PI에 의해 유도된 골형성 단백질인 Runx2와 BMP-2 단백질 발현 을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 FSE는 PI에 의해 유도된 혈관 석회화를 MAPK 기전의 ERK, p38의 인 산화 억제를 통해서 이루어 진다는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보아 FSE는 혈관석회화에 의해 유도 된 혈관질환에 예방효과가 있을 것으로 사료된다. 추후, FSE 에 의한 평활근세포에서의 혈관 석회화 관련 좀 더 정교한 신호 기전 연구를 위한 추가 실험이 요구된다.