I. 서 론

갯무(Raphanus sativus var. hortensis f. raphanistroides Makino, Korea wild radish)는 십자화과속에 해당하는 뿌리 채소이다. 이러한 무는 주로 아시아의 해안가에 분포하고 있 으며, 전통적으로 다양한 음식과 한약재로 사용해 왔다 (Gutierrez & Perez 2004). 우리나라에서의 갯무는 제주도 해안가에 주로 자생하고 뿌리가 작고 잎이 세서 뿌리는 김 치로 이용하고 어린잎을 이용하여 식용으로 사용하고 있다. 갯무의 폐놀계 화합물, ferulic acid, glucosinolate 그리고 sulforaphane과 같은 화합물은 항산화, 항염증 그리고 항암작 용이 있다고 연구되어 왔다(Lugasi et al. 2005;Kim et al. 2006;Yamanoshita et al. 2007;Choi et al. 2009;Beevi et al. 2010). 제주 갯무 성분에 관한 연구는 아직 미비하며 그중 기존 재래종 무의 주성분인 sulforaphane의 함량 비교 한 연구에서 sulforaphane의 함량이 재래종 무보다 높다고 보 고된 연구결과가 있다(Choi et al. 2009).

치매는 발생 기작에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer’s disease, AD), 혈관성 치매(vascular dementia)로 크게 나뉘 며, 특히 알츠하이머성 치매는 전체 치매 환자의 50-60%를 차지하는 60세 이상의 고령인구에게 주로 발병되고 매우 진 행속도가 빠른 대표적인 치매의 한 형태이다(Francis et al. 1999). 알츠하이머성 치매의 환경적 요인과 신체적 요인으로 나누어 볼 수 있는데. 연령, 유전적 원인, 환경적 영향에 의 한 독성물질 등이 외부적 원인으로 거론되고 있으며, 내부적 원인으로는 아세틸콜린(acetylcholine) 농도 저하로 인한 신 경전달물질의 감소, 사이토카인(cytokine) 등에 의한 신경염 (neuroinflammation)발생, 아밀로이드 베타 (Beta-amyloid, Aβ) 및 과인산화된 타우 단백질(tau)의 응집에 의한 세포독 성, 산화스트레스에 의한 활성산소의 신경세포 사멸 등이 알 려져 있다. 신경세포에 아밀로이드 베타라는 이상단백질이 뇌 안에 축적되어 시냅스의 손상을 가져오고 주변 글리아 (glia) 세포의 활성을 일으키며 이로 인한 다양한 염증반응, 세포사멸반응, 산화적스트레스 반응 등에 의하여 뇌세포 사 멸을 일으킨다(Schliebs 2005;Birla et al. 2020;Bhatia & Sharma 2021).

아세틸콜린(Acetylcholine, ACh)은 신경전달물질이자 조절 물질이며, 학습과 기억과 같은 인지기능에 필요한 신경전달 물질이다(Ferreira-Vieira et al. 2016). 아세틸콜린 분해효소의 이상 작용으로 과하게 분해된 아세틸콜린의 분해를 아세틸 콜린 분해효소(아세틸콜린에스터라아제) 저해제는 콜린성 신 경전달 물질의 증가를 도움으로써 치매성 인지기능 저하 증 상을 완화하는 치료제로 사용되고 있다(Schneider 2003). 최 근에는 천연물 및 식품 소재로부터 아세틸콜린 분해효소 저 해제 기능을 하는 물질에 대한 연구가 활발하다(Prasasty et al. 2018).

무스카린성 콜린 수용체(muscarinic cholinergic receptor) 길항제로 사용되는 스코폴라민(scopolamine)은 중추신경계에 서 콜린성 뉴런 기능을 저해하고 산화적스트레스를 일으키 어 기억력 손상을 발생 하는 것으로 알려져 있어 기억력 및 인지기능 효능을 검증하고자 할 때 콜린성 기억력 감퇴의 동 물 모델로 많이 사용되고 있는 약물이다(Flood & Cherkin 1986).

현재까지 사용되고 있는 치매 치료제인 도네피질(donepezil), 갈란타민(galantamine)등은 경, 중도 알츠하이머병에 사용되 고 있으며 주로 증상을 완화하는 용도로 쓰이고 있다. 신경 세포의 사멸은 여러 뇌 질환에 공통된 근본적인 병리로 지 적되고 있어 세포사멸을 유발하는 인자와 분자 기전에 대한 연구가 심층적으로 이루어지고 있지만, 기존에 개발된 아세 틸콜린 분해효소 저해제라든가, 광범위한 세포사멸억제제는 부작용과 더불어 임상 효과가 감소하여 이 효능과 알츠하이 머성 치매 관련 기전을 조절하는 새로운 천연물 및 식품 소 재 개발이 필요하다. 그러므로 본 연구에서는 신경세포 및 기억력 저하 유도 동물 모델에서 새로운 소재인 제주 갯무 추출물의 신경보호효능 및 기억력 증진 효능을 구명하고자 하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 연구재료

아밀로이드 베타(Beta-Amyloid, Aβ)는 American peptide (Aβ1-42, sunntvale, CA, USA) 제품을 사용하였다. 세포배 양 배지로 사용된 Dulbecco’s modified Eagel’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제 (antibioticantimycotic solution)은 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, 그 외 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reagent와 dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HIFP) 은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

웨스턴블롯 분석을 위한 단백질분해효소 및 포스파타아제 저해제는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) 제품을 사용하였고, 일차 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), Abcam (Cambridge, Massachusetts, US)에서 구입하였다.

WR 추출물을 DMSO에 녹여 최종 농도 100 mM로 만들 어 사용하였고, 세포에 처리되는 DMSO 농도는 0.001% 이 하가 되도록 하였다. 아밀로이드 베타는 배지에 1 mg/mL이 되도록 녹인 후, 실온에서 4일 동안 aggregation되도록 하였 다. 이 펩타이드를 마이크로 원심분리기 튜브에 옮겨 담아 2 시간 동안 증발기(EYELA, Tokyo, Japan)으로 건조시킨 후, 최종 농도 1 mM이 되도록 DMSO에 녹여서 사용하였다.

2. 갯무 추출물(WR 추출물) 제조

갯무 채취는 2015년 4월 제주도에서 채취하여 식물전문가 로부터 감정을 받았으며 지상부와 지하부 모두를 사용하여 50도에서 열풍 건조하였으며 50% 주정추출물로 추출하여 동 결건조하여 사용하였다. 갯무 채취 후 사진 촬영 및 식물 전 문가 감정 의뢰 후 시료로 사용하였고(KFR-MAT-0087), 건 조된 시료를 에탄올 또는 물 추출한 후 농축하여 분말화 하 여 사용하였다(시험에 쓰인 분석 시료는 광동제약이 제조하 여 공급함).

3. 세포배양 및 neuronal toxicity 모델 확립

인간 유래 SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 10% FBS, 1% A/A를 포함하는 DMEM 배지 조성으로, 5% CO₂및 37°C 온도 조건으로 유지 배양하였다. 세포 배양은 2일마다 새로운 배지로 갈아주었으며, 실험을 위하여 적절한 밀도로 세포를 분배한 다음 세포가 안정적으로 부착되면 FBS가 없 는 serum free media에 시약과 함께 처리하여 실험하였다. 세포생존율을 측정하기 위하여 MTT 환원법을 이용하였다. SH-SY5Y 세포를 96-well plate에 3.5×10⁵/mL의 밀도로 분 주한 다음 세포가 안정적으로 부착되면 다양한 농도 (1,5,10,50, 100 μM)의 WR 추출물과 아밀로이드 베타 (25 μM)을 24시간 처리하여 배양하였다. 24시간 후, MTT 용액 을 가하여 3시간 동안 반응시킨 다음 200 μL의 DMSO로 살아있는 세포에 생성된 formazan 결정을 용해시켰다. 보라 색으로 발색된 용액을 540 nm 파장에서 흡광도 측정기 (microplate reader, Tecan, Melbourne, Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였고 상대적인 세포생존률(%)을 대조군의 흡광도 100% 기준으로 하여 산출하였다.

4. 단백질 발현 측정

세포 내 단백질 발현 변화를 측정하기 위하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 6-well에 세포를 분주한 후, WR 추출물 과 베타아밀로이드 시약 처리가 끝난 세포에 단백질추출용 액(Elpis biotech, Daejeon, Korea)를 가하여 용해시킨 다음, 핵/세포질 분획 kit (Biovision Inc., Milpitas, CA, USA)을 이용하여 핵과 세포질의 단백질로 분리하였다. 단백질을 정 량 후 30 μg의 단백질을 4-15% SDS-PAGE로 20 mA에 1 시간 동안 전기영동 하였다. 이후 전기영동 된 단백질을 80V 에서 1시간 30분 동안 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 이동하였으며 5% 탈지 분유를 사용하여 실 온에서 1시간 동안 블로킹 시켰다. 1차 항체들은 1:500-1000 농도로 4°C, overnight 조건으로 반응시킨 다음, TBST로 10 분간 3회 세척 후, 이차 항체들은 1:3000-5000 농도로 실온 에서 1시간 배양시켰다. TBST로 3회 세척 후 enhanced chemoluminescence (ECL) reagent (LI-COR, Lincoln, NE, USA)로 발색 시켰으며, ChemiDoc 기기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질 밴드 발현도를 측정 하였다.

5. 아세틸콜린 분해효소 저해 활성 측정

아세틸콜린 분해효소 저해 활성 측정은 아세틸콜린 iodide 를 기질로 사용하여 흡광도를 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 균질화하여 원심분리 후 상등액을 효소로 사용하고 PBS buffer로 희석 후 아세틸콜린 iodide 용액과 Ellman’s 용액을 혼합하여 30분간 반응시켰다. 이후 410 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 모든 실험법은 공급사인 Invitrogen사의 매뉴얼대 로 실시하였다(Molecular Probes, USA).

6. 인지기능 장애 동물 모델 확립

인지기능 장애 동물 모델을 구축하기 위하여 스코폴라민 을 주사하여 콜린성 뉴런을 손상시킨 후 동물 행동 실험을 평가하였다. 체중 260-268 g 내외의 흰쥐(SD, Sprague- Dawley)를 샘타코(주) (Osan, Korea)로부터 구입하였다. 실 험 동물은 온도 21±2°C; 습도 50-60%; 12시간 주기 명/암 하에서 일반고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 사 육실 적응을 완료한 후 실험에 사용하였고 모든 동물 실험 은 동물실험은 한국식품연구원 동물윤리위원회의 윤리 규정 에 의거하여 실시하였다. 정상군을 제외한 모든 실험 동물은 스코폴라민을 2 mg/kg로 14일 동안 1일 1회 복강 주사하여 동물 모델을 구축하였다. 실험군 분류는 기억력 감퇴를 유발 시키지 않은 정상군(NOR), 스코폴라민을 투여하여 해마 부 위 손상을 유발시킨 다음 음용수만 투여한 대조군(SCO), 스 코폴라민을 대조군과 동일한 방법으로 투여한 다음, WR 추 출물을 100 mg/kg 투여군(WR100), 200 mg/kg 투여군 (WR200)으로 구분하였다. 모든 실험 동물은 각 군마다 6 마 리씩 사용하였다. WR 추출물은 1일 1회 100 mg/kg 또는 200 mg/kg의 용량으로 스코폴라민 투여 30분 전에 경구투여 하였다.

7. 모리스 수중 미로 장치 및 절차

실험 제10일부터 실험동물의 공간 기억 평가를 위한 수중 미로시험을 실시하였다. 수중 미로에 이용되는 수조는 직경 이 180 cm 높이가 50 cm인 원형 통으로 온도가 22±2°C 되 는 물을 30 cm 높이로 채웠다. 수중 미로의 주변은 비디오카 메라, 실험대, 그리고 실험대 위에 있는 수온 조절용 장치 등 공간단서들을 일정하게 유지하였다. 도피대는 직경이 15 cm 인 원형 투명 아크릴에 받침대를 부착하고, 수면보다 1.5 cm 낮게 위치시켰다. 수조 내의 물은 탈지분유를 풀어서 도피대 를 보이지 않게 하여 시각 단서를 이용할 수 없게 하였다. 수중미로는 4개의 동일한 사분원으로 나누어져서 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)로 구분되고 이중 북동 사분 원의 중심부에 도피대가 놓여 지고, 나머지 중 하나를 출발 위치로 사용하였다. 쥐는 4일 동안 매일 입수하는 사분면을 달리하여 하루 4번씩 반복하여 인지적응 훈련(acquisition test)을 수행하였다. 실험동물이 도피대의 위치에 도달하면 10 초 동안 도피대에 머물게 하였으며, 180초 안에 도피대를 찾 지 못할 경우에는 10초 동안 도피대에 올려놓고 기억하도록 하였다. 실험 5일째에는 working memory를 측정하기 위하 여 자유수영 검사(retention test)가 시행되는데, 이때 동물들 은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게 하였다. 모든 동물들의 행동은 비디오카메라로 녹화하였으며, 훈련 시행에 서는 출발에서부터 도피대로 올라가는데 걸린 시간을 측정 하였고, 60초간의 검사시행에서는 훈련시에 도피대가 가 있 었던 사분원에 머문 시간을 S-MART 프로그램(Pab Lab, Spain)을 이용하여 측정하였다.

8. 해마 세포 밀집도 측정

모든 행동 실험이 끝난 직후 실험동물을 sodium pentobarbital (80 mg/kg, 복강 투여)로 마취시킨 후, 식염수 200 mL에 이 어 4% paraformaldehyde 고정 용액을 심장을 통하여 천천 히 관류 고정 하였다. 고정 후 적출한 뇌를 같은 고정액으로 24시간 동안 후고정시키고, 20% sucrose가 함유된 phosphate buffered saline (PBS)에 넣어 4°C에서 가라앉을 때까지 보 관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌조직에서 해마 부 위를 30 μm의 두께로 냉동관상절편 한 후 Cresyl violet으로 염색하고 Scion image program (Scion Corp.)을 이용하여 세포 밀도를 측정하였다.

9. Statistics

모든 측정값은 평균값±표준 오차 평균(mean±SEM)으로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS를 이용하였다. 각 집단간 행동 측정치의 비교는 repeated ANOVA test를 시행하였고, 조직분석법의 측정값은 one-way ANOVA를 시행하였으며, 사후 검정은 Tukey test 를 적용하였다. 전체 실험의 통계적 인 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.

III. 결과 및 고찰

1. WR 추출물의 뉴런 세포 사멸 억제 효과 검증

SH-SY5Y 세포를 분주하여 24시간 배양 후, 준비한 응집 된 아밀로이드 베타를 처리하여 16-24시간 배양하고 MTT를 이용하여 세포생존률을 측정한 결과, SH-SY5Y cell에서의 WR 추출물에 대한 독성은 없었고, 아밀로이드 베타를 처리 하였을 때는 55%로 세포생존율이 감소하였고, 농도가 증가 함에 따라 세포생존율도 증가하였다. 세포생존율이 유의적으 로 증가한 100 μg/mL 농도에서는 세포생존률이 70%로 약 15.3% 증가하였다<Figure 1>. 이는 WR 추출물이 치매의 한 원인으로 알려져 있는 베타아미로이드에 대한 뉴런세포 독 성을 억제하였으므로 항치매효과가 있음을 증명하였다.

2. WR 추출물의 아세틸콜린 분해효소 저해 효능

아세틸콜린 분해효소(AchE) 저해제에 의한 아세틸콜린 분 해 억제는 알츠하이머 질병의 환자들을 위한 치료 방법 중 하나이다. 새로운 아세틸콜린 분해효소 저해제를 개발하여 항치매 치료제를 개발하고자 하는 노력이 진행중이다. 본 실 험에서는 베타 아밀로이드 독성에 대한 뉴런 세포 사멸 억 제 효능을 보인 WR 추출물이 아세틸콜린 분해효소 저해 효 능이 있는지 확인하고자, 아세틸콜린 분해효소 활성 실험을 실시하였다. <Figure 2>에서 보는바와 같이 150% 였던 아세 틸콜린 분해효소의 활성을 WR 추출물 50, 100 μg/mL로 처 리한 군에서는 활성이 50% 이하로 감소시키는 것을 확인 하 여 WR 추출물이 아세틸콜린 분해효소 저해제로서의 효능이 있음을 확인 할 수 있었다.

3. WR 추출물의 세포성장 및 분화에 관여하는 MAPK 키나 아제 활성 조절 효능

WR 추출물의 세포 보호 효능의 기전을 알아보고자 웨스 턴블롯 분석법으로 세포성장 및 분열 분화에 관여하는 인자 인 MAPK 키나아제의 활성을 측정하였다. WR 추출물을 100 μg/mL 처리하고 15분 간격으로 60분 동안 배양한 결 과, 15분에서 대조군보다 1.3 배 증가하여 가장 높은 활성을 나타내었고 60분 반응이 되자 활성이 대조군 수준으로 감소 되는 것을 확인하였다. 이는 WR 추출물이 세포 생존에 관 여하는 MAPK 키나아제 조절에 관여한다고 할 수 있다. 또 한, 염증 및 세포사멸 기전에 관여하는 JNK의 활성을 측정 한 결과도 마찬가지로 15분에서 가장 높은 활성을 나타낸 후, 30분후부터 활성이 감소되는 것을 확인하였다<Figure 3>. 이러한 결과로 볼 때, WR 추출물이 MAPK 키나아제 중 Erk의 인산화 활성을 나타내고 활성화된 JNK가 하위 기 작을 조절하여 세포사멸을 억제하였을 것으로 예상된다.

4. 기억력에 대한 WR 추출물의 효과

스코폴라민으로 기억 손상을 유발한 흰쥐의 공간 학습에 대한 WR 추출물의 효과를 알아보기 위하여 신경 구조중 해 마에 의한 공간 학습 능력을 평가하는 모리스 수중 미로 실 험법을 <Figure 4>에 나타내었다. 마우스에 4일 동안 인지 훈련을 실시하였을 때, 스코폴라민 처리군(SCO)은 시험 훈 련 기간 동안 도피대의 위치를 찾아가는 시간이 대조군 (CON)에 비해 유의하게 증가하였으며, WR 추출물 투여군 (WR)은 시험훈련 3일째 이후부터 도피대를 찾아가는 시간 이 유의적으로 감소하였다. 훈련 5일째 도피대를 제거한 후 탐지시험을 시행한 결과 도피대를 제거한 사분면에 머무는 시간이 스코폴라민 투여군(SCO)은 16.6±0.8초로 정상군 (NOR)의 23.5±1.0초보다 현저히 감소하였다. WR 추출물을 투여한 WR100 및 WR200군은 각각 20.3±1.9초 및 21.7± 0.7초로 대조군(CON)과 근접한 결과를 보여주었으며, 특히 200 mg/kg를 투여한 군에서는 통계적을 유의한 증가를 보여 주었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, WR 추출물은 스코폴 라민으로 유도한 흰쥐의 장기기억, 공간 기억력 그리고 관련 된 학습의 개선에 효과가 있는 것으로 사료된다.

5. 해마의 신경세포 밀도에 대한 WR 추출물의 효과

스코폴라민으로 기억 손상을 유발한 흰쥐의 해마 (hippocampus)부위 CA1 지역 내 신경세포 밀집도 측정을 위해 cresyl violet으로 염색한 후 Scion image program (Scion Corp.)을 이용하여 세포 밀집도를 측정하였다. 그 결 과, 해마의 CA1 영역의 신경세포 밀집도는 스코폴라민 투여 군 (SCO)은 22.8±2.8로 정상군(NOR)의 밀집도 41.3±6.1에 비하여 생존세포들이 유의하게 감소하였다. 그러나 WR 추 출물을 투여한 WR100 및 WR200군은 각각 24.1±2.5 및 33.8±3.0로 스코폴라민 투여군(SCO)에 비하여 농도의존적으 로 증가하는 양상을 보였으나, 통계적 유의성은 없었다 <Figure 5>. WR 추출물은 스코폴라민으로 유도된 해마 신 경세포의 손실 방어에 효과가 있을 것으로 추측되나, 뉴런 마커 및 DNA합성에 관한 마커 염색등의 정교한 연구가 추 가적으로 필요한 것으로 사료된다.

IV. 요약 및 결론

본 연구에서는 제주 갯무의 뇌신경보호 효과를 확인하기 위해, 세포 실험과 동물실험을 통해서 신경세포의 사멸을 억 제하고 기억력 증진 효능이 있음을 확인하고자 하였다. 아밀 로이드 베타를 SH-SY5Y세포에 처리하여 세포 사멸 모델을 유도하고 50% 주정 갯무 추출물을 동시처리하여 효능을 확 인한 결과, 아밀로이드 베타로 인해 사멸되었던 신경세포는 갯무 추출물 처리군에서 세포생존률이 증가함을 나타내었다. 어떠한 기전으로 세포사멸을 억제하는지 확인하기 위하여 MAPK 키나아제의 인산화 조절을 확인한 결과, 갯무 추출물 은 세포의 생존에 관여하는 MAPK 키나아제의 인산화를 증 가시킴으로써 세포사멸 억제 기전을 조절하는 것으로 확인 하였다. 또한 갯무 추출물은 아세틸콜린 분해효소 활성 저해 효과가 있음을 확인하였다. 스코폴라민 유도 기억력 저하 모 델 마우스에 갯무 추출물을 투여하여 수중미로실험과 수동 회피실험 행동실험을 실시한 결과, 기억력감소를 저해하고 단기 기억력이 증진됨을 확인하였다. 조직학적으로 기억력을 주관하는 해마 조직의 세포사멸을 억제함을 확인하였을 때 도 갯무 추출물은 스코폴라민 처리군보다 신경세포 손상을 억제하여 신경보호 효과가 있음을 확인하였다. 추후, 갯무 추 출물의 성분 분석 및 재래종 무와의 성분 분석 비교를 통하 여 어떠한 지표성분이 갯무에 포함되어 있고 이러한 성분들 이 신경보호 활성 및 다른 생물학적 활성을 나타내는지 추 가 분석 실험이 요구된다.