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ISSN : 1225-7060(Print)
ISSN : 2288-7148(Online)
Journal of The Korean Society of Food Culture Vol.36 No.2 pp.235-245
DOI : https://doi.org/10.7318/KJFC/2021.36.2.235

Anti-proliferative and Apoptotic Activity of Extracts of Lindera glauca Blume root in Human HCT116 Colorectal Cancer Cells

Yeah-Un Kim1, Ha-Rin Moon2, Inhwa Han1, Jung-Mi Yun2*
1Department of Food and Nutrition, Kwangju Women’s University
2Department of Food and Nutrition, Chonnam National University
*Corresponding author: Prof. Jung-Mi Yun, Department of Food and Nutrition, Chonnam National University, 77 yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju, 61186, South Korea Tel: +82-62-530-1332 Fax: +82-62-530-1339 E-mail: sosung75@jnu.ac.kr
March 15, 2021 April 5, 2021 April 7, 2021

Abstract


Lindera glauca Blume has been used in Korean traditional medicine to treat the symptoms of paralysis, abdominal pain, speech disorders, extravasations, contusions, and pain caused by rheumatoid arthritis. We investigated the effect of L. glauca Blume extracts on the proliferation of colorectal cancer cells in vitro using HCT116 human colorectal cancer cell lines. We also investigated its mechanism of action. For this purpose, we used the MTT assay, western blotting, DNA fragmentation analysis, and flow cytometry. HCT116 cells were cultured in several concentrations of ethanol extracts of L. glauca Blume root (0, 50, 100 μg/mL). In this study, colon cancer cell growth was inhibited by L. glauca Blume root extract in a dose-dependent manner. It was associated with induction of apoptosis as assessed by nuclear fragmentation and cell cycle analysis. Apoptosis was assessed using western blotting for TNF-α, IL-6, NF-κB, Caspase-3, PARP, Bax, Bcl-2, and SIRT1. The extract also dose-dependently upregulated the expression Bax, the pro-apoptotic gene and downregulated the expression of the anti-apoptotic gene Bcl-2. Furthermore, the extract enhanced Caspase-3 activity in a dose-dependent manner. Our findings provide evidence that L. glauca Blume extract may mediate its anti-proliferative effect via the modulation of apoptosis.


Lindera glauca Blume , anti-proliferative activity , apoptosis , HCT116 , colorectal cancer cells

감태나무 뿌리 추출물에 의한 대장암세포의 성장억제 및 세포사멸유도

김 예언1, 문 하린2, 한 인화1, 윤 정미2*
1광주여자대학교 식품영양학과
2전남대학교 식품영양학과

초록

    I. 서 론

    암은 유전적, 비유전적 원인으로 인체 면역기전이 손상되 어 정상 세포가 무한증식 및 돌연변이화되어 생성된다고 보 고되고 있다(Novotny & Szekeres 2003). 대장은 소화 및 흡수되고 남은 음식물이 머무르는 곳으로 많은 종류의 세균 이 번식하고 있고, 특히 S상결장과 직장은 암이 생기기 쉬운 부위이다(Gustin & Brenner 2002). 국내의 대장암 발생률은 갑상선암과 위암에 이어 3위를 차지하고 있을 정도로 중요 한 암종이다(Lim & Jun 2019). 특히 대장암은 다른 암들보 다 증상이 늦게 나타나 통증을 느낄 때에는 거의 말기에 접 어든 상태이며 대장암은 외과적 수술로 약 80%의 절제술을 시행함으로써 치료할 수 있음에도 불구하고 생존율이 50% 밖에 되지 않기 때문에 발병에 앞서 예방에 큰 관심이 집중 되고 있다(Jemal et al. 2007).

    최근 여러 가지 암을 예방하기 위해 전통 생약재 및 과일 채소 등 천연물 소재에서 항암 성분을 탐색하고 발굴하는 연 구가 활발하게 이루어지고 있으며(Hu et al. 2016), 화학적 암 예방 식품 소재는 암세포의 증식 및 전이 등을 차단을 통 해 항암 작용을 나타내는 것으로 보고된다(Sun et al. 2004;Shin et al. 2017). 비정상적인 암세포 성장을 제어하기 위해 서 세포사멸 기전을 유도하는 것은 암 예방 및 암 치료의 표 적이 될 수 있으며, 최근 다양한 종양 세포에서 세포사멸을 유도하는 항암제에 관한 연구들이 많이 보고되고 있다(Lowe & Lin 2000;Wenzel et al. 2000;Song et al. 2005). 대 표적으로 포도 껍질에서 분리한 레스베라트롤(resveratrol)을 비롯하여 다양한 식물유래 생리활성물질 등이 있으며 이들 은 여러 암 연구에서 예방 및 치료 효과를 보이고 있다 (Mosmann 1983;Vermes et al. 1995). 아포토시스(apoptosis) 는 병리 상태뿐만 아니라 정상 조직의 생체 항상성에 반드시 필요한 세포 자가사멸이다(Vaux & Korsmeyer 1999;Hidalgo 2003). 아포토시스는 탈수에 의한 세포 수축, 세포 내 칼슘이 온 농도 증가, DNA 분절, 염색질 응축, phosphatidylserine 이 세포막 밖으로 노출되는 등 다양한 생리적 현상이 동반 되며 최종적으로 apoptotic body 형성과 함께 식세포 작용을 거치는 일련의 과정을 의미한다(Lee & Kim 2011). 즉, 아 포토시스는 세포 형태와 내부의 생화학적 변화로 말미암아 세포가 주변에 영향을 주지 않고 죽는 것으로 정리된다. 아 포토시스 경로는 extrinsic pathway와 intrinsic pathway로 구분된다(Baliga & Kumar 2003). Intrinsic pathway는 미토 콘드리아 의존적인 아포토시스 과정으로서 약물, 방사선 및 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 등과 같은 여러 가지 자극 때문에 미토콘드리아 외막에 존재하는 Bcl-2 family의 발현에 영향을 주게 되면 미토콘드리아 막 전위 (mitochondrial membrane potential, MMP)의 소실로 인해 세포질로 방출된 cytocrome c가 Apaf-1을 형성하여 caspase-9을 활성화시키고, caspase-9은 하위 신호의 caspase- 3, -6, -7의 활성을 유도하는 경로이다. 그리고 extrinsic pathway는 death receptor인 Fas, TNF receptor를 경유하여 Fas-associated death domain protein (FADD), caspase-8의 활성을 일으키는 경로이다(Zou et al. 1999;Bratton et al. 2001;Baliga & Kumar 2003;Donovan & Cotter 2004;Letai 2005). Caspase-3, Bax는 아포토시스 과정을 활성화하 는 단백질로, Bcl-2는 아포토시스를 억제하는 단백질로 알려 졌다(Green & Reed 1998;Ashkenazi & Dixit 1999;Park et al. 2009).

    대장에서의 만성염증은 대장암의 발생 증가와 높은 상관 관계를 갖으며, 이미 여러 연구에서 대장암의 발생에 있어서 도 염증성 장질환이 암의 발생 및 진전에 밀접한 관련이 있 음이 확인된 바 있다(Lee & Seo 2019). 이미 우리의 선행 연구에서 감태나무 추출물에 의해서 p53 gene mutation type HT-29 대장암세포 증식억제활성이 있음을 확인하였다 (Kim & Yun 2015). 따라서 본 연구에서는 인체 대장암 세 포주 p53-null HCT116를 가지고 암세포증식억제기전을 연 구하고자 하였다.

    감태나무(Lindera glauca Blume)은 낙엽과에 속하는 낙엽 관목으로 중국, 한국, 대만의 산악 지대에 널리 분포한다(Suh et al. 2015). 감태나무의 열매는 복통 및 언어 장애를 포함 한 마비 증상을 치료하기 위한 전통생약제로 사용된다. 감태 나무의 잎은 독의 영향을 막고 출혈을 막기 위한 민간 치료 제로 사용하고 있다. 또한 감태나무의 뿌리는 전통적으로 류 마티스 관절염으로 인한 유출, 타박상 및 통증에 대한 치료 제로 의약품으로 사용하고 있다(Niu et al. 2015;Yu et al. 2017). 감태나무에서 분리된 생리활성물질로는 alkaloid, diarylpropanoids, sesquiterpenoid, flavonoid, phenolic compound 와 steroid가 있으며(Seki et al. 1994;Seki et al. 1995;Chang et al. 2000;Chang et al. 2001, Huh et al. 2011;Huh et al 2012), 최근 연구에서는 감태나무의 질소화합물과 monoterpene이 항암 활성을 나타낸다고 보고된 바 있다 (Wang et al. 2011). 그 중 감태나무 가지의 메탄올 추출물 이 Sulforhodamine B (SRB) 검정에서 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, HCT-15 세포에 대해 우수한 세포 활성을 가졌 다고 알려졌다(Wang et al. 2011). 감태나무에 관한 연구로 는 항산화 효과(Kim et al. 2019a), 항균활성(Yang et al. 1999), LDL-항산화 활성(Huh et al. 2014), 항염 작용(Ruan et al. 2020) 등 선행연구들이 있다. 그러나 감태나무 뿌리의 항종양 활성에 대해서 보고된 바가 없다.

    따라서 본 연구는 HCT116 인간 대장암 세포에 감태나무 뿌리의 에탄올 추출물을 처리함으로써 암세포 성장억제 및 그 기전으로 아포토시스 유발 등을 확인하고자 하였다.

    II. 연구 내용 및 방법

    1. 실험재료

    본 실험에 사용된 Lindera glauca Blume root (감태나무 뿌리)은 식품의약품안전처 식품원재료 데이터베이스에서 식 용 가능함을 확인한 약초로서 광주광역시 광산구 월곡동 월 곡시장(Gwangju, Korea) 구입하였다. 세포배양에 사용된 RPMI 1640 배지 및 fetal bovine serum (FBS), protease & phosphatase inhibitor cocktail and BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Waltham, USA)에서 구입하였다. NucBusterTM protein extraction kit는 Novagen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. phosphate-buffered saline (PBS), 0.25% trypsin-EDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. DMSO, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 3-(4-5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide (MTT), RIPA buffer는 Biosesang (seongnam, Korea)에서 구입하였다. Chemiluminescence (ECL) solution kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. Nuclear factor-κB (NF-κB), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), caspase- 3, Bax, Bcl-2 항체는 Cell signaling (Danvers, MA, USA) 에서 구입하였다. Interleukin-6 (IL-6), Tumor necrosis factor-α (TNF-α), SIRT1, β-actin 1차 항체와 2차 항체인 anti-mouse IgG-HRP, anti-goat IgG-HRP 및 anti-rabbit IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA) 에서 구입하였다.

    2. 추출물의 제조

    본 연구에 사용된 감태나무 뿌리는 분말 건조 시료 g당 8 배의 99.9% 에탄올을 가하여 교반하였다. 교반한 용액을 환 류 냉각 50°C에서 2시간 교반하여 추출의 과정을 3번거치고 여과하여 얻었다. 이렇게 얻어진 추출액을 회전진공농축기 (rotary vacuum evaporator, BUCHI Labortechnik AG, Switzerland)로 감압농축, 건조하여 고형물의 함량을 산출하 였다. 감태나무 뿌리 추출물 수율(%)은 [추출 분말의 무게 (g)/처음 사용한 시료(g)]×100으로 나타내었다. 사용 때까지 –20°C에서 보관하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 사 용하였다.

    3. 세포배양

    HCT116는 인간 대장암 유래 세포주로 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로부터 분양을 받아서 사용하였다. HCT116 세포배양을 위해 사용한 RPMI 1640 배지에 10% FBS를 첨가하고 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 1% penicillin을 첨가한 다음 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO2 incubator (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA)에서 배양하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 0.25% trypsin- EDTA를 처리하여 계대 배양하여 사용하고 passage 수치가 10이 넘어가면 폐기하였다.

    4. 세포 증식 억제능 측정

    감태나무 뿌리 추출물의 HCT116 세포 증식억제 실험을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. HCT116 세포는 96 well plate에 1×105 cells/well의 양으로 분주하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 제 거한 다음 각 시료를 RPMI 1640 배지로 희석하여 대조군에 는 시료 대신 PBS를 100 μL씩 첨가하고 다른 각 well당 시 료를 100 μL씩 첨가한 후 다시 37°C, 5% CO2 incubator에 서 24시간 배양한 후 MTT (1 mg/mL) 용액을 각각 200 μL씩 첨가하여 4시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배 양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양 후 formazan 형성 을 현미경으로 관찰하고 바닥에 형성된 formazan 결정이 흐 트러지지 않도록 주의하면서 모든 well의 배지를 제거하고 각 well에 DMSO 200 μL씩 첨가한 후 ELISA reader (Biochrom, Cambridge, UK)를 이용하여 흡광도 570 nm에 서 측정하였다.

    5. Western blot analysis

    HCT116 세포를 1×105 cells밀도로 100 mm dish에 분주 하여 24시간 안정화되도록 배양하였다. FBS free media로 교체해준 후 일정 농도의 감태나무 뿌리 추출물을 처리하여 48시간 배양한 다음 cell pellet을 만들었다. Total cell lysate 를 만들기 위해 세포를 ice-cold PBS로 헹구고, RIPA buffer [150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA (pH 8.0)]와 protease & phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (Thermo Scientific, USA)를 첨가하여 교반하였다. 침전물은 10,000 rpm, 4°C, 10분간 원심분리하 여 제거한 후 상층액을 취해 whole cell lysate로 사용하였다. Nuclear lysate는 NncBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, San Diego, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. Lysate의 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 정량하였다. Cell lysate를 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후 nitrocellulose membrane (Invitrogen, novex, USA)에 이동시켰다. Membrane은 5% skim milk blocking buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween)에서 2시간 동안 blocking하고 1차 항체 (1:1,000~5,000 희석)를 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후 2차 항체 lgG-HRP를 첨가하여 2시간 동안 교반한 다음 ChemiDoc (BIO-RAD Laboratories, CA, USA)을 이용하여 각 단백질의 양을 탐색하였다. 단백질들의 발현 정도는 ECL solution (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 측정하 였다. 분자량은 Broad-range pre-stained protein marker (Elpls, USA)와 비교, 분석하였다.

    6. DNA 분절 현상 측정

    정상 배지에서 자란 세포와 감태나무 뿌리 추출물이 처리 된 배지에서 자란 세포를 모은 다음 원심분리를 이용하여 상 층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 세포에 100 μL PBS와 100 μL lysis buffer를 처리하여 ice bucket에서 30분간 반응 시킨 다음 4°C, 14,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 분 리된 상층액에 1 mg/mL의 RNase를 처리하여 37°C에서 45 분 동안 반응시킨 다음 phenol:chloroform=1:1, sigma을 450 μL씩 첨가하고 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였 다. 상층액을 추출하여 차가운 100% 에탄올과 10M ammonium acetate를 넣고 −80°C에서 30분 이상 보관하였 다. 그 후 4°C, 14,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층 액을 버리고 70% 에탄올을 넣어 다시 4°C, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 건조하여 DNA sample을 만들었다. 각 DNA sample을 2.0% agarose gel에 서 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (ErBr)로 염색하여 ultra violet (UV)하에서 사진 촬영하여 DNA 분절 여부를 확인하였다.

    7. 세포주기 측정

    Sub-G1 단계의 세포 수를 측정하기 위해 세포주기 분석을 수행하였다. 세포를 6 well plate에 1×106 cells/well의 양으 로 분주하고, 다양한 농도의 감태나무 뿌리 추출물로 48시간 동안 처리하였다. 세포에 trypsin 처리 후 PBS로 세척한 다 음 −20°C에서 밤새 70% 에탄올로 고정시켰다. 고정된 세포 를 PBS로 세척하고 차가운 Propidium Iodide (PI; Sigma- Aldrich)용액에 현탁시키고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 Cytomic FC500 flow cytometer (Beckman Coulter, Istanbul, Turkey)를 이용하여 세포주기를 분석하였다.

    8. 통계처리

    실험 결과는 3번의 반복실험 하였으며, 그 결과를 평균±표 준편차로 나타내었다. 각 실험 결과의 통계적 유의성 검토하 기 위해 SPSS (version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 Student’s t-test에 의하여 판정하였다. p값 이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

    III. 결과 및 고찰

    1. 감태나무 뿌리 추출물 처리에 의한 HCT116 암세포 성장 억제효과

    건조된 감태나무 뿌리 100g의 에탄올 추출 수율은 9.07% 로 산출되었다. HCT116 세포 증식에 감태나무 뿌리 추출물 이 미치는 영향을 알아보기 위해 추출물을 0, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL 농도로 처리하고 48시간 동안 배양하여 조 사하였다. 측정된 흡광도는 MTT가 세포에 의해 환원된 양 을 나타내며, 따라서 이 값은 각 well에 살아있는 세포수와 비례한다. 추출물을 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하였 을 때의 상대적인 세포 성장 억제능으로 나타냈다. <Figure 1A>와 같이 감태나무 뿌리 추출물 처리 농도가 증가함에 따 라 HCT116 세포 생존율이 감소하는 것으로 확인하였다. IC50는 시료 농도에 따른 암세포 성장 억제능 변화 곡선으로 부터 암세포를 50% 성장 억제시키는 농도를 표시한 것이다. <Figure 1A>에서 보여지는 것과 같이 HCT116 세포에서 IC50값은 1016.27±259.03 μg/mL로 HCT116 세포 성장을 억 제하는 것으로 확인하였다. 우리의 연구와 유사하게 대장암 세포에 다양한 추출물을 처리하여 세포 성장을 억제하는 연 구가 많이 진행되고 있다. Kim et al.(2019b)의 연구에서 대 장암세포 SW480 세포에 상동나무 잎과 가지 추출물을 처리 하였을 때 세포 성장을 억제하는 것을 확인하였다(Kim et al. 2019b). 또한 Jo et al.(2007)의 연구에서도 대장암세포 HT-29 세포에 만형자 추출물을 처리하였을 때 암 세포 성장 을 억제 효과를 확인했다(Jo et al. 2007). 이와 같이 본 연 구 결과 감태나무 뿌리는 HCT116 세포의 성장 생존율이 유 의성을 가지고 농도 의존적으로 감소함을 확인함으로써 감 태나무에는 이러한 생리활성을 나타내는 유용성분을 함유하 고 있을 것이라고 생각된다. 선행연구들을 보면 현재까지 감 태나무에는 (+)-3-chloro-N-formylnornantenine, (+)-N-formylnornantenine, (+)-norboldinelo, (−)-norboldine, lysicamine, akolactone A, methylparaben, phytol, squalene, β-sitosterol, β-sitostenone, stigmasta-4,22-dien-3-one, 6β-hydroxy-β-sitostenone, 6β-hydroxystigmasterone, β-sitosteryl-D-glucoside, linderanosides A, linderanosides B, linderanoside C가 알려져 있고(Chang et al. 2000;Chang et al. 2001), 그중에서 lysicamine, β- sitosterol, β-sitostenone는 위암과 전립선암의 항산화 및 암세 포증식효과가 보고된바 있으며 phytol은 유방암세포의 증식 억제효과가 보고된바 있다(Liu et al. 2014;De Alencar et al.). 이렇듯 현재까지는 감태나무의 대장암 증식억제능에 관 여하는 유용성분에 대해서는 더 많은 추가 연구가 필요하다.

    2. 감태나무 뿌리 추출물 처리에 의한 DNA 분절 유도효과

    아포토시스 진행 시 발생하는 DNA 분절은 세포 내 endonuclease가 활성화되어 DNA가 180-200 bp 길이로 절편 화되며 발생하는 것으로 알려지고 있다(Reed 2001). 감태나 무 뿌리 추출물의 HCT116 세포의 증식억제의 기전을 연구 하기 위해 DNA 분절을 확인하였다. <Figure 1B>와 같이 감태나무 뿌리 추출물에 의하여 HCT116 세포의 DNA 분절 화를 관찰하였다. 감태나무 뿌리 추출물을 처리하지 않은 경 우 DNA 분절이 관찰되지 않았지만 처리한 경우에는 추출물 농도(0, 50, 100 μg/mL)가 증가함에 따라 DNA laddering현 상이 증가하여 아포토시스가 유도되었음을 알 수 있다. 생약 재 및 식품 추출물을 이용하여 아포토시스 세포사멸을 확인 하기 위해서 여러 연구에서는 일련의 연구로 DNA 분절을 확인한 바 있다. Lee et al.(2008)의 연구에서 아보카도 추출 물을 암세포에 처리하였을 때 DNA 분절이 증가하는 것을 확인했다(Lee et al. 2008). 또한, Yoon & Kim(2008)의 연 구에서는 MCF-7 유방암세포에 천련자 메탄올 추출물을 처 리하였을 때 DAN 분절 현상이 농도 의존적으로 증가한 것 을 확인했다(Yun & Kim 2008). 즉, 감태나무 뿌리에 의한 세포 증식 억제 효과는 아포토시스와 밀접한 연관성이 있음 을 확인하였다.

    3. 감태나무 뿌리 추출물 처리에 의해 Caspase의 활성 및 PARP분절

    Caspase는 cystein protease로 아포토시스의 중요한 조절인 자로 작용한다(Debatin 2004). 최근 연구에 의하면 암세포의 아포토시스를 유도하는 천연물은 caspase의 활성을 증가시키 는 것으로 보고된다(Jo et al. 2005;Ye et al. 2005). Caspase는 여러 종류가 존재하며 서로 상호작용을 한다. 아 포토시스 하위의 effector caspase를 활성화하는 initiator caspase에는 caspase-8와 caspase-9가 있으며, 두 caspase는 서로 다른 경로(intrinsic & extrinsic pathway)에 의해 활성 화되어 그 하위 신호인 caspase-3의 활성화로 이어져 세포의 자가사멸이 일어난다(Delhalle et al. 2003). Effector caspase 인 caspase-3는 PARP를 절단하여 아포토시스를 유도하는 중 요한 단백질 효소 중의 하나이다(Lazebnik et al. 1994). 감 태나무 뿌리 추출물 처리에 의한 caspase 활성과 PARP의 분 절을 확인하기 위하여 HCT116 세포에 추출물을 0, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후 westernblot assay를 이용하여 확인하였다. 그 결과 농도 의존적으로 procaspases 3의 발현이 감소하였음을 확인할 수 있었으며, 89kDa의 PARP의 cleavage도 관찰되는 것을 알 수 있었다 <Figure 1C>. 따라서 감태나무 뿌리 추출물에 의해 procaspases 3가 활성화되고 PARP 단백질을 분해하여 HCT116 세포의 아포토시스가 유도됨을 확인할 수 있었다. 우리의 연 구결과와 유사하게 Shin et al.(2009)에 의한 연구에 따르면 흑마늘 추출물 처리 농도에 따라 pro-caspase 3 발현을 감소 시키고 PARP의 분절을 유도함을 보고하였다(Shin et al. 2009). 또한 Kim et al.(2016)의 연구에서도 A549 폐암 세 포에서 개똥쑥 추출물을 처리하였을 때 caspase-3 발현이 농 도 의존적으로 감소되었고 PARP 분절을 유도함을 확인하였 다(Kim et al. 2016). 이와 같이 본 연구의 감태나무 뿌리 추출물이 caspase-3를 활성화 시키고 PARP의 분절을 일으켜 아포토시스를 유도한 것으로 생각된다.

    4. HCT116 세포의 Bcl-2와 Bax의 발현에 감태나무 뿌리 추 출물 처리가 미치는 영향

    Bcl-2 family는 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 단백 질로 미토콘드리아 막에 존재하거나 세포사멸 유도 신호에 의해 미토콘드리아 막으로 이동하여 세포사멸을 조절하는 중 요한 역할을 한다(Alves et al. 2007). Bcl-2 family에 속하 는 Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Bax, Bad, Bak, Bid, Bcl-xs 등은 아포토시스의 경로를 조절하는 중요한 역할을 한다고 알려 져 있다(Lee et al. 2007). Pro-apoptotic 단백질 Bax는 미토 콘드리아의 막 투과성을 증가시키고, cytochrome c의 방출을 증가시킴으로써 아포토시스를 유도한다. 반면, anti-apoptotic 단백질 Bcl-2는 pro-apoptotic 단백질과 heterodimer를 형성 하여 pro-apoptotic 단백질의 활성을 억제하여 아포토시스를 막는다(Korsmeyer et al. 1993). Bcl-2와 Bax의 발현 정도 를 확인하기 위하여 HCT116 세포에서 추출물을 0, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후에 westernblot assay를 이용하여 결과를 확인하였다<Figure 1D>. 감태나무 뿌리 추출물을 농도별로 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백 질인 Bcl-2 단백질 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며, pro-apoptotic 단백질 Bax의 발현 수준은 증가하는 것으로 확 인하였다. 우리의 연구와 유사하게 Kim et al.(2013)의 연구 에서도 HCT-15세포에 미역 발효추출물을 처리하였을 때 Bcl-2가 감소되었고, Bax는 증가한 것을 확인하였다(Kim et al. 2013). 또한 Guon et al. (2017)의 연구에서도 인체 대장 암 HCT116 세포에서 우전 추출물이 농도 의존적으로 Bcl-2 를 감소시켰고, Bax를 증가시키는 것을 확인했다(Guon et al. 2017). Park et al. (2010)의 연구에서 인체혈구암세포에 상황버섯 추출물을 처리하였을 때 Bcl-2가 감소되었고, Bax 는 증가한 것을 확인하였다(Park et al. 2010). 이와 같이 본 연구의 감태나무 뿌리 추출물이 Bcl-2가 감소시키고 Bax는 증가시킴으로서 intrinsic pathway 아포토시스를 유도한 것으 로 생각된다.

    5. 감태나무 뿌리 추출물이 세포주기에 미치는 영향

    아포토시스 유도는 세포주기에 따라 달라질 수 있다는 것 은 잘 알려져 있다(Malumbres & Barbacid 2009). 많은 항 암제가 G1, S기 및 G2/M에서 세포주기 진행을 억제하고 Sub-G1에서는 아포토시스를 유도하여 암세포증식을 억제하 는 것으로 보고되고 있다(Khan et al. 2020). 또한 다양한 추출물을 이용하여 여러 암세포의 cell cycle arrest를 통해 세포증식을 억제하는 연구가 많이 진행되고 있다. Khan et al.(2020)의 연구에서 인간 전립선암 PC-3 세포에 모링가 잎 메탄올 추출물을 처리하였을 때 아포토시스를 유발하는 Sub- G1이 농도 의존적으로 증가한 것을 확인했다(Khan et al. 2020). Doan et al.(2020)의 연구에서도 인간 간암 HepG2 세포에 Chrysophyllum cainito 줄기 추출물을 처리하였을 때 Sub-G1이 증가하는 것을 확인했다(Doan et al. 2020). Lee et al. (2020)의 연구에서 구강암 세포에 두송 추출물을 처리 하였을 때 세포 성장을 억제하는 Sub-G1이 증가하고, S기는 감소한 것을 확인했다(Lee et al. 2020). Huang et al.(2020) 의 연구에서 아리수나무 추출물을 인간 간암세포에 처리하 였을 때 Sub-G1이 증가한 것으로 확인했다(Huang et al. 2020). 현재 우리의 연구에서는 감태나무 뿌리 추출물이 세 포주기에 미치는 영향을 알아보기 위해 HCT116 세포에 추 출물을 농도별(0, 50, 100 μg/mL)로 48시간 처리하여 flow cytometry를 통해 분석하였다. 세포주기 변화를 확인한 결과 감태나무 뿌리 추출물 농도가 증가함에 따라 Sub-G1의 비율 이 증가한 반면, G1 및 S기는 감소되었다<Figure 2>. 따라 서 감태나무 뿌리 추출물이 HCT116세포가 농도 의존적으로 Sub-G1에서 세포 주기의 교란을 통해 아포토시스를 유발한 다고 생각된다.

    6. 염증성 사이토카인과 NF-κB 유전자 발현에 감태나무 뿌리 추출물의 영향

    염증반응이란 대식세포를 포함한 면역세포들이 항원의 침 입이나 조직손상과 같은 자극에 의해 손상 부위로 이동하여 항원을 제거하고, 손상의 결과로 생성된 물질을 제거하는 것 을 말하며(Lundberg 2000), 생명체의 생존에 필수적인 기능 으로 최근에는 염증반응이 신경계 퇴행 및 만성질환의 진행 초기부터 관여할 수 있으며 병리 현상의 완급을 조절하고 세 포의 생존과 사멸 조절에 적극적으로 관여한다고 알려졌다 (Skaper 2007;McGeer & McGeer 2008). 대식세포는 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 하는 세포로 NO, 사이토 카인 등과 같은 염증 매개물질을 생산하여 염증반응에 관여 하게 되는데, 정상수준의 염증반응은 생체방어로서 체내의 항상성을 유지하지만 염증 매개물질이 과량 생산되면 염증 성 질환을 유발함으로써 숙주에 치명적인 결과를 초래할 수 있다(Lee et al. 2000;Rocca & FitzGerald 2002). TNF-α 와 IL-6는 활성화된 대식세포로부터 생성되는 대표적인 염 증성 사이토카인으로서 초기 염증반응의 발달에 중요한 역 할을 한다(Lin et al. 2004). TNF-α는 대식세포와 비만세포 등에서 분비되며, 많은 자가 면역 질환에서 염증의 개시 및 유지에 핵심적 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 종양 세포 에서는 세포 독성 작용을, 염증 세포에서는 염증 유발 작용 을 하여 세포의 증식과 분화를 조절한다(Pierce et al. 2001;Delgado et al. 2003). Interleukin-6 (IL-6)는 선천면역과 적 응면역 모두에서 기능을 하는 사이토카인이다. IL-6는 다기 능성 사이토카인으로 림프성 혹은 비림프성 세포 즉, 단구, B세포, T세포, 혈관내피세포, 섬유모세포 등에서 생성되고 있 으며 면역반응, 급성 염증반응 등에 관여한다(Kaplanski et al. 2003). NF-κB는 면역과 염증 반응을 조절하는 전사조절 인자로서 세포 증식이나 변형과 관련되는 세포 신호를 전달 하여 TNF-α와 같은 pro-inflammatory cytokine 등과 같은 다양한 자극 때문에 활성화되어 세포의 immortalization, proliferation, apoptosis 및 inflammation 등에 관여하는 유전 자의 발현을 조절하고 NF-κB의 과도한 활성화는 암을 포함 한 다양한 질병 유발과 연관되어 있다(Silverman & Maniatis 2001;Hayden & Ghosh 2004). 최근 연구에서는 사이토카 인 과잉 발현이 악성 종양의 진행에도 관련되어있는 것으로 보고되고 있다(Kawamura et al. 2012). 따라서 염증 및 암 치료에 있어 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 감소시 키는 것이 중요하다. 본 연구에서는 감태나무 뿌리 추출물 처리에 의한 염증 관련 유전자 발현의 영향을 확인하기 위 해 HCT116 세포에 추출물을 0, 50, 100 μg/mL 농도로 처 리하고 48시간 배양한 후에 westernblot assay를 이용하여 확인하였다. <Figure 3A>에 제시한 바와 같이 TNF-α와 IL- 6는 감태나무 뿌리 추출물 처리에 따라서 농도 의존적으로 감소시켰고 염증성 사이토카인의 전사인자인 NF-κB의 발현 이 HCT116 세포 핵 내에서 추출물의 농도에 의존적으로 감 소시킴을 확인하였다<Figure 3B>. 즉 감태나무 뿌리 추출물 은 HCT116 세포 증식에 관여하는 염증을 저해함으로써 암 세포증식억제에 관여하는 것으로 생각된다.

    7. 감태나무 뿌리 추출물 처리가 HCT116 세포의 SIRT1 발 현에 미치는 영향

    효모의 수명을 조절하는 유전자인 SIR2의 고등동물 상동 유전자(homologue)인 SIRT1 (sirtuin)은 핵에 존재하는 단백 질로 NAD-의존성 탈아세틸화 효소활성을 가지고 있는데 이 를 통하여 다양한 단백질을 탈아세틸화하여 세포 성장, 노 화, 죽음, 대사, DNA 손상의 수복 등 다양한 세포기능의 조 절을 통하여 동물의 노화와 수명, 특히 노화기의 건강 상태 에 중요한 결정자로서 작용한다(Luo et al. 2000;Yeung et al. 2004). 최근 SIRT1은 항암제 등 치료제의 타깃으로 연구 가 활발히 진행되고 있고(Haigis & Guarente 2006), 염증 및 암 전이를 촉진하는 NF-κB 경로를 억제하는 것으로 알 려져 있다(Yeung et al. 2004;Wang et al. 2009). 정상상태 에서 세포가 DNA 손상을 입었을 때, 종양 억제유전자인 p53은 세포주기를 정지시킨다(Amaral et al. 2010). 세포가 복구할 수 없는 손상을 입게 되면 Bax, Bcl-2, Caspase와 같은 단백질들은 발현시켜 아포토시스를 유도하는 것으로 알 려져 있으므로 p53 유전자가 암의 발생과 예방 및 치료에 중 심적인 역할을 하여 강조되고 있는 한편 HCT116 세포는 p53 돌연변이가 원인인 악성 종양에 해당된다(Sheu et al. 2010). 대표적인 종양 억제 유전자인 p53의 발현을 중재하는 SIRT1은 HCT116세포의 아포토시스를 일으키는 주요한 조 절인자이다. 감태나무 뿌리 추출물 처리에 의한 SIRT1의 활 성을 확인하기 위하여 HCT116 세포에 추출물을 0, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후에 westernblot assay를 이용하여 확인하였다. <Figure 4>에 제시한 바와 같 이 감태나무 뿌리 추출물의 농도가 증가함에 따라 SIRT1 단 백질 발현이 증가하였다. 이러한 비슷한 경향성은 여러 추출 물 연구에서 찾아볼 수 있는데 최근 야관문 추출물이 인간 대장암 HCT116 세포에서 SIRT1 발현이 증가하는 것으로 보고하였고(Zhao et al. 2016), Sung et al.에 의한 연구에 따르면 Humulus japonicus 추출물을 처리하였을 때 SIRT1 과 p-AMPK의 발현이 증가한 것으로 알려져 있다(Sung et al. 2015). 우리의 이러한 결과는 종양 억제 유전자 발현 및 염증 관련 기전에 관여하는 SIRT1의 발현을 적어도 부분적 으로 감태나무 뿌리 추출물에 의해서 조절됨을 알 수 있다.

    IV. 요약 및 결론

    본 연구는 감태나무 뿌리 추출물의 인체 대장암세포 성장 억제 효능 및 그 기전을 연구하였다. 감태나무 뿌리 추출물 을 0, 50, 100 μg/mL 농도로 48시간 처리하여 암세포 증식 억제 효과를 측정한 결과 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인하였다. HCT116 세포에 대한 감태나무 뿌리 추출물의 IC50 값은 1016.27±259.03 μg/mL로 확인되었다. 또한 감태 나무 뿌리 추출물을 처리한 HCT116 세포에 대한 세포 성장 억제 기전을 확인한 결과 pro-caspase 3의 발현이 감소함에 따라 PARP 및 DNA 분절을 확인하고 anti-apoptotic 단백질 인 Bcl-2를 감소시켰으며 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 수 준을 증가시키는 것으로 확인하였다. 염증 관련 유전자 TNF- α, IL-6 그리고 그 전사인자인 NF-κB는 감태나무 뿌리 추출 물 처리 시 농도 의존적으로 감소하였고 유전자 SIRT1의 발 현량은 증가하는 것을 확인하였다. 종합적으로, 본 연구의 결 과는 감태나무 뿌리 추출물 처리에 따라 아포토시스 (apoptosis)를 통한 HCT116 암세포증식억제를 유도하는 것 으로 확인하였다. 감태나무 뿌리의 기능성 소재로 활용할 수 있음을 확인하였으며 앞으로 감태나무 뿌리의 질병에 대한 효능 및 기전 연구가 지속하여야 할 것으로 생각된다.

    저자 정보

    김예언(광주여자대학교 식품영양학과, 석사, 0000-0003- 0127-0363)

    문하린(전남대학교 식품영양학과, 석사과정, 0000-0003- 4219-4045)

    한인화(광주여자대학교 식품영양학과, 교수, 0000-0002- 3671-3331)

    윤정미(전남대학교 식품영양과학부, 교수, 0000-0001-6044- 0647)

    Conflict of Interest

    No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

    Figure

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    Effect of L. glauca Blume extract on cell growth and apoptotic mechanism in HCT116 cells.

    (A) Effect of L. glauca Blume extract on the viability of HCT116 colorectal cancer cells. Cells were treated with various concentrations of L. glauca Blume extract for 48 hr. Cells viability was measured by MTT assay. (B) Effect of L. glauca Blume extract on DNA fragmentation in HCT116 cells. (C) Effect of L. glauca Blume extract on PARP cleavage and caspase-3 activation in HCT116 cells. (D) Effect of L. glauca Blume extract treatment to HCT116 cells on the expression of Bcl-2 family proteins and Bax/Bcl-2 ratio. Mean±SD of three independent experiments.

    The significance was determined by a Student’s t-test (*p<0.05)

    KJFC-36-2-235_F2.gif
    Effect of L. glauca Blume extraction treatment to HCT116 cells on cell cycle.

    (A) HCT116 cells were treated with 0, 50, 100 μg/mL L. glauca Blume extract for 48 hr, and the cell cycle distribution was determined by using a Cytomic FC500 flow cytometer. Histograms display sub-G1, G1, S, and G2/M phase of HCT116 cell. (B) The percentage of cells undergoing apoptosis represented by Sub-G1 was plotted as a bar chart for 0, 50, 100 μg/mL respectively. Mean±SD of three independent experiments. The significance was determined by a Student’s t-test (*p<0.05)

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    Effect of L. glauca Blume extraction the expression anti-tumor-related proteins HCT116 cells.

    (A) Effect of L. glauca Blume extract on inflammatory related genes TNF-α and IL-6 in HCT116 cells. HCT116 cells were treated with 0, 50, 100 μg/mL L. glauca Blume ethanol extract for 48 hr, collected and then lysed. Lysates from the cells were subjected to westernblot assay for TNF-α, IL-6, and β-actin as estimated by westernblot assay. (B) Effect of L. glauca Blume extract of activation of NF-κB in HCT116 cells. HCT116 cells were treated with 0, 50, 100 μg/mL L. glauca Blume ethanol extract for 48 hr, collected and then lysed. Lysates from the cells were subjected to westernblot assay for NF-κB and Histone 1

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    Effect of L. glauca Blume extract on SIRT1 activation in HCT116 cells.

    HCT116 cells were treated with 0, 50, 100 μg/mL L. glauca Blume extract for 48 hr, collected and then lysed. Lysates from the cells were subjected to westernblot assay for SIRT1 and β-actin. Specific band intensities were measured using a densitometer and SIRT1 induction was calculated as SIRT1/β-actin ratio. Mean±SD of three independent experiments. The significance was determined by a Student’s t-test (*p<0.05)

    Table

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