I. 서 론
우리나라의 전통장류는 콩 발효식품으로서, 콩은 양질의 단백질과 지방의 함량이 풍부하여 쌀이나 보리 중심의 우리 식생활에 부족하기 쉬운 필수 아미노산 및 지방을 보충해주 고 있다(Choi et al. 1998).
간장은 비타민의 함량이 된장에 비해 미량이지만 methionine 은 간의 해독작용을 도와 체내에 유독한 유해물질 제거에 관 여하고, 알코올 및 니코틴 해독작용으로 술, 담배의 해를 줄 이고 미용에도 효과적일 뿐만 아니라 레시틴이 함유되어 콜 레스테롤을 용해하여 동맥경화 예방과 혈압 강하작용을 한 다(Lee & Cho 1971;Yanagida 1995;Yoo 1997;Choi et al. 2007). 이 외에도 정장작용을 돕고, 혈관을 부드럽게 하 여 혈액을 맑게 하며, 비타민의 체내 합성을 촉진하는 등 (Kobayashi et al. 2004;Park 2010) 다양한 기능성이 확인 됨에 따라 간장과 된장 모두 식품학적 가치를 재조명 받고 있다(Kim et al. 1989;Joo et al. 1992a;Joo et al. 1992b).
간장은 제조되어 장기간의 발효 숙성 기간을 가지며 주로 세균 주도형으로 발효 숙성이 이루어져, 다른 나라의 콩 발 효식품과는 발효 및 숙성 기간, 발효미생물 종류 등에서 차 이를 보인다(Kim & Rhee 1990;Ryu et al. 1993;Kim & Kim 1999). 최근 우리나라의 주거 형태와 사회 구조의 변화 로 인해 가정에서 제조 · 섭취하였던 간장보다는 공장에서 제조된 간장의 사용이 증가하고 있다. 그러나 공장에서 제조 시판되는 제품은 코지를 사용하여 제조하고 있기 때문에 고 유 장 맛에서 차이가 있다.
전통간장은 간장의 제조 원료가 되는 메주의 제조 과정이 약 2개월이 소요되고, 간장의 발효 및 숙성 기간이 약 6개월에서 1년 정도의 장기간이 소요되므로 산업화가 어려워 간장의 쓰 임새에 따라 소비량은 많으나 생산량이 적은 문제점이 있다 (Park et al. 2000;Ahn & Bog 2007). 더불어 보고된 연구에 따르면 된장은 주로 숙성 기간이 1년 미만인 된장의 발효미생 물(Kang et al. 1999), 생리활성(Kaneko et al. 1994;Oh & Kim 2006;Shim et al. 2008;Won et al. 2012), 향기성분 (Bae et al. 2002;Kwon et al. 2010) 등에 집중되어 있다.
암은 한국인의 단일질환으로 가장 높은 사망률을 보이며, 더불어 막대한 사회, 경제적 부담을 유발하는 질환 중 하나 이다. 기존의 항암제는 단기적으로 치료효과를 보이나 많은 부작용과 함께 면역력 저하에 의한 암의 재발 등 심각한 문 제를 갖고 있다. 최근 기존 항암치료법의 한계를 극복하고 보완할 수 있는 면역세포 치료제가 대두되고 있다. 다양한 면역세포중에 자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)의 경우 직접적으로 암의 발생, 증식, 전이 및 재발을 막는데 효 과적이라는 연구가 보고 되고 있다(Vivier et al. 2008). 식품 소재의 항암 기능은 수년 동안 많은 연구가 진행되고 있고 그중 식품이나 식품성분을 이용한 면역세포 치료제에 대한 관심은 기존 항암제 개발과 더불어 최근 이슈가 되고 있다. 대표적인 식품소재로는 콩 유래 genistein, 강황 유래 curcumin, 인삼추출물, 마늘 추출물 항산화 효능 뿐 아니라, 전립선암, 유방암, 대장암에서 자연살해세포 활성을 나타낸다고 보고되 었으며(Yun et al. 1987;Messina et al. 1994;Bhaumik et al. 2000;Ishikawa et al. 2006), phenolic 성분인 resveratrol 과 ashwagandha 추출물, 금귤추출물, 겨우살이 추출물 등이 간암세포, 대장암세포, 혈액암세포에서 자연살해세포 활성기 능을 나타내는 등 다양한 식품소재에서 자연살해세포 활성 을 촉진 시켜 새로운 면역세포치료에 대한 기대를 높이고 있 다(Braedel 2010;Barua et al. 2013;Nagahama et al. 2015;Rauf et al. 2018).
본 연구에서는 간장의 암 예방 및 항암효과를 확인하기 위 해 대표적인 항암 세포주를 이용하여 숙성기간을 달리한 다 양한 간장의 항암 세포주의 사멸을 확인하였고, 또한 NK cell의 활성을 증대시킴을 확인하여 전통식품인 간장이 항암 작용의 중요한 역할을 한다는 것을 구명하고자 한다.
II. 연구 내용 및 방법
1. 시험물질
1) 실험재료
전통 장류를 제조하고 있는 전국의 전통장류업체에서 숙 성기간별로 간장 20종을 수집하였고, 일본 간장은 5년 미만 의 제품을 국내 마켓에서 구입하여 냉장보관 후 실험에 사 용하였다. 본 논문상에는 시판 제품임을 고려하여 제품명은 기재하지 않고 표 1과 같이 일련변호로 표기하였다. 본 제품 은 숙성 기간에 따라 크게 4가지 숙성도로 하여 단기숙성은 숙성기간이 5년 미만(S), 중기숙성은 10년 미만 (M), 장기 숙성은 15년 미만 (L), 초장기숙성은 15년 이상 (E)으로 분 류하였다. 시판되는 일본간장의 경우 숙성기간에 대한 정보 가 없어 따로 표기하지 않았다.
2) 시험물질의 조제
시험물질은 실험에 사용하기 전까지 냉동 보관하였고 모 든 시료는 증류수에 완전히 용해 후 0.45 μm syringe filter 로 여과하여 실험에 사용하였다. 각 시료의 농도별 희석은 세포 배양 배지로 희석하였으며 제조된 시료는 냉장 보관 하 에 7일 간격으로 새로 제조하였다<Table 1>.
2. 항암 효능 평가
1) 시험 세포주
실험에 사용된 A549 (인체폐암세포) 세포, NK cell의 sensitive 세포로 알려진 lymphoma YAC-1 (마우스 림프종세 포) 세포 및 HepG2 (인체간암세포) 세포는 한국세포주은행 (KCLB, Korea)으로부터 구입하였으며 작용세포로 사용하기 위한 비장세포는 SD rat 5주령에서 분리하여 사용하였다. 세 포는 37°C, 5% CO2 incubator에서 각 배지에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)또는 10% bovine serum (BS; Gibco, USA)과 100 U/mL의 penicilin-streptomyocin (Gibco, USA)을 첨가하여 배양하였다. 세포가 60-70% 정도 confluent되면 phosphatate buffered saline solution (PBS)로 2번 씻어내고 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 모은 후 계대 배양하고 배양액은 2-3일마다 교환하였다.
2) Cell viability assay
간장이 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈구 계수기(haematocytometer)로 계산된 세포를 비장세포의 경우 1×105 cells/well, A549의 경우 1×104 cells/well, YAC-1의 경우 1×105 cells/well, HepG2의 경우 1×104 cells/well로 하여 96 well plate에 분주한 뒤 10% fetal bovine serum과 100 U/mL의 penicilin-streptomyocin이 혼합된 minimum essential medium eagle (MEM; Gibco, USA)배지에 배양한 후 시료를 처리하여 반응시켰다. 그 다음 WST-1 시약을 100 μL당 10 μL씩 첨가하여 반응시킨 뒤 microplate reader (Infinite 200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 다음과 같은 공식을 이용하여 산출하였다.
Cell viability (%) =(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
2. 비장세포 분리
Balb/c 마우스의 비장을 적출하여 penicillin (100 U/mL), streptomycine (100 μg/mL)을 함유한 RPMI 1640배지로 3 회 세척한 후 균질화 하였다. 세포 부유액을 70 μm nylon mesh를 이용하여 여과하고 원심 분리하여 림프구를 모은 다 음 배지에 부유시키고 원심 분리하여 림프구를 분리하였다. effector cell로 사용하기 위하여, 10% FCS, 2 mM Lglutamine, penicillin, streptomycine을 함유한 RPMI 1640 배지로 재 부유시키고, 이것을 37°C 5% CO2 incubator에서 1~2시간 배양시켜 culture dish에 부탁시켰다. 비부착성 NK cell을 원심 분리하여 수집하였고 배양배지에 부유시킨 후 자 연살해세포 활성 분석에 사용하였다. 본 연구에 사용된 동물 실험은 인비보 동물실험윤리위원회의 승인(IV-17-1701-01) 후 수행하였다.
3. 자연살해세포(NK cell) 활성 분석
비장세포(effector cell)는 96 well plate에 5×106 cells/mL 로 농도별 시료와 함께 처리하고, YAC-1 세포(Target cell)를 이용하여 effector cell과 target cell의 비율별(1:20)로 첨가한 후 37°C, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 LDH 측정은 CytoTox detection kit (Takara)를 사용하여 측정하였으며, 반응액내에 NAD의 산화로 의해 형성된 MTT는 490 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조 사하였다.
4. 통계 분석
각 군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA (one-way analysis of variance test) Duncan 사후검정 비교 를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정 하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
III. 결과 및 고찰
1. 간장의 폐암세포 증식 억제 효능
간장이 폐암세포에 미치는 영향을 확인하고자 A549의 세 포 증식률을 비장세포의 세포 증식률과 비교 분석한 결과 300 μg/mL의 농도에서 숙성 기간별 간장을 24시간 처리한 결과 15년 이상 숙성된 간장(E group)과 일본 시판 제품 (G21, G22)의 경우 비장세포의 증식률을 감소시키고 폐암세 포의 증식률을 증가시키는 것으로 나타났다. 반면 8년산 간 장 실험군(G10; M group)은 30.9%로 폐암세포의 증식을 가 장 많이 감소시켰고, 비장세포의 증식을 증가시켰으며, 3년 산 간장 실험군(S group)이 18.6%, 9년산 간장 실험군(M group)이 13.5% 순으로 높은 항암 활성을 보였다. 본 시험결 과 간장은 10년 이하로 숙성한 것 (S, M group)이 폐암세포 의 증식률을 감소시키는 데 효과적인 것으로 확인하였다 <Figure 1, 2>. 이러한 결과는 1년~3년 숙성시킨 전통된장의 항암효능을 확인하였을 때 숙성연도별로 대장암세포주와 유 방암세포주에서의 항산화 효능 및 항암효능이 증가한 결과 와 유사한 결과이다(Kwon & Shon 2004). 발효 및 숙성과 정에서의 이화학적 변화에 따른 성분변화, 미생물의 변화가 다양하게 변화되어 이에 따른 효능의 차이가 나타낼 것으로 생각되며 추후 이를 위한 숙성기간별 성분분석 연구를 진행 할 예정이다.
2. 간장의 림프종 세포 증식 억제 효능
숙성 기간별 간장이 마우스 림프종 유래의 암세포의 증식 에 미치는 영향을 확인하고자 YAC-1의 세포 증식률을 비장 세포의 세포 증식률과 비교 분석하였다. 300 μg/mL의 농도 에서 숙성 기간별 간장을 24시간 처리한 결과, 11~30년 숙 성된 간장과 일본 시판 제품에서 비장세포 증식률에 비하여 A549의 세포 증식률이 증가되는 것으로 나타나 암세포의 증 식을 높이는 것으로 나타났다. 반면 10년산 간장 실험군(L group)이 21.4%로 가장 높은 항암 활성을 보였으며, 5년산 간장 실험군(S group)이 16.6%, 8년산 간장 실험군(M group)이 13.0% 순으로 높아 5~10년의 숙성기간에서 림프종 세포의 증식률을 감소시키는 것으로 확인되었다<Figure 3, 4>. 이러한 결과는 10년 이하로 숙성된 간장의 폐암세포주의 증식 억제에 미치는 영향과 유사한 결과임을 알 수 있었다.
3. 간장의 간암세포 증식 억제 효능
간장이 간암 세포에 미치는 영향을 확인하고자 HepG2의 세포 증식률을 비장세포의 세포 증식률과 비교 분석하였다. 300 μg/mL의 농도에서 숙성 기간별 간장을 24시간 처리한 결과, 11~30년 숙성된 간장과 일본 시판 제품에서 비장세포 증식률에 비하여 HepG2의 비장세포 증식률이 증가되는 것 으로 나타나 암세포의 증식을 높이는 것으로 나타났다. 반면 8년산 간장 실험군(M group)이 22.7%로 가장 높은 항암 활 성을 보였으며, 5년산 간장 실험군(S group)이 6.8% 등으로 3~10년의 숙성기간 (S, M group)에서 간암세포의 증식률을 감소시키는 것으로 확인되었다<Figure 5, 6>.
4. 간장의 비장세포 증식 효능
종류별 간장이 비장세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과 300 μg/mL의 농도에서 24시간 경과 시 일본 시판 제 품의 1년산 간장 실험군(JG1 group)이 60.9±1.0%로 가장 낮은 활성을 보였고 그 다음으로 일본 시판 제품의 2년산 간 장 실험군(JG2 group)이 61.6±1.6%로 나타나 일본에서 시판 되는 간장이 비장세포의 생존율을 감소시키는 것으로 확인 되었다. 국내 간장의 경우 11년산 이상의 간장에서는 활성이 70% 수준으로 감소되는 것으로 나타나 숙성기간이 10년을 초과하는 간장(L group)에서는 비장세포의 증식률을 감소시 키는 것으로 확인되었다<Figure 7>. 비장세포의 증식은 비장 의 B세포와 T세포의 Th세포 및 Tc 세포 모두를 증가시킨 것으로 생각되어 질 수 있으며 10년 이하의 숙성간장에서의 비장세포의 증식은 항암작용과 더불어 면역세포 증가에도 영 향을 나타내었음을 알 수 있다.
5. 간장의 NK세포 활성 증가 효능
항암치료에 있어서 면역세포치료는 인체의 면역세포인 수 지상세포(dendritic cell), NK세포, T세포 등을 이용하여 체내 면역반응을 활성화 시켜 질병을 치료하는 방법이다. 그 중에 서도 최근 활발히 연구되고 있는 면역세포치료법은 NK 세 포를 기반으로 한 치료이다(Long et al. 2013) NK 세포는 항암면역치료제 개발 측면에서 다른 면역세포들에 비해 많 은 장점을 가진다. NK세포는 암세포의 발생, 증식, 전이를 억제할 뿐 아니라 암의 재발에 가장 중요한 암 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있다고 보고된 바 있다(Castriconi et al. 2009). NK세포의 작용 기전 중 항암효과와 관련 있다고 밝혀진 기전은 항체 의존성 세포 매개형 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)과 자연세포독 성 수용체(Natural cytotoxicity receptors NCRs)들에 의해 매개되는 자연살해 기전이다. 본 연구에서는 숙성이 다른 간 장이 이러한 NK세포의 활성을 높임으로서 항암기작에 관여 할 것으로 생각되어 Target cell인 YAC-1세포와 effector cell인 splenocyte를 이용하여 숙성기간별로 선별된 간장이 NK cell 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 시험을 진행한 모든 종류의 간장은 농도의존적인 경향을 보이지는 않았으나 숙성기간이 가장 짧은 1년산 간장 실험군(S group) 은 모든 농도에서 타 실험군에 비해 낮은 활성을 보이는 것 으로 나타났다. 시료 처리 농도가 가장 높은 300 μg/mL에서 1년산 간장 실험군(G1 group)은 22.9±2.8%, 7년산 간장 실 험군(M group)은 63.0±2.9%, 10년산 간장 실험군(L group) 은 50.7±3.8%, 30년산 간장 실험군(E group)은 56.7±2.3%, 일본 시판 제품의 1년산 간장 실험군(JG1 group)은 55.4± 5.4%로 조사되어, 7년간 숙성시킨 간장 (M group)이 자연살 해세포의 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다<Figure 8>.
이러한 결과는 항암세포주의 cytotoxicity와 유사한 결과를 나타내었으며, 이는 숙성기간에 따른 성분 변화에 의해 차이 를 나타낼 것으로 예상되며 추후 숙성기간별 성분 분석을 통 해 숙성기간에 따른 성분변화와 활성과의 관계를 확인해 볼 필요가 있다. NK cell은 다른 항암면역세포와 달리 추가적인 활성화 과정 없이 암세포를 감지한 후 바로 제거할 수 있는 데 이는 다양하게 존재하는 면역수용체를 통해 암세포와 정 상세포를 구분하기 때문이다. 위의 결과를 토대로 간장이 이 러한 NK cell의 활성을 나타낸다면 추후, 암의 진단, 예후 예측 등에 활용 될 수 있을 것으로 생각된다.
IV. 요약 및 결론
한국 전통 발효 식품인 간장의 암 예방 및 항암 증진 효능 을 위해 숙성기간을 달리하여 제조한 간장을 이용하여 폐암, 간암, 림프암 3종의 항암 세포주를 이용하여 항암 효능을 확 인하였다.
숙성을 달리한 간장의 경우 모든 암세포주에서 활성을 보인 숙성기간은 3년(G2 group), 5년(G7 group), 8년(G8 group), 10 년(G12 group)으로 나타나 숙성기간이 3~10년인 간장(S, M group)에서 높은 암세포 증식 억제율을 보이는 것으로 나타났 으며 이 중에서는 10년 숙성한 M group을 300 μg/mL 처리하 였을 때, 가장 높은 항암활성을 보이는 것으로 확인 하였다.
최근 항암 면역치료제 개발 측면에서 자연살해세포(NK cell)의 활성연구는 암 재발의 위험이 있는 암 줄기세포를 제 거하고, 부작용이 현저히 감소 될 수 있다는 다양한 장점 때 문에 항암 연구에 중요한 세포면역치료로 대두 되고 있다. 본 연구에서는 간장의 직접적인 항암세포의 독성 뿐 아니라, 면역치료제로서의 기능을 할 수 있는 NK cell의 활성도 확 인하였다. NK cell의 활성은 7년 숙성한 간장(M group)에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
또한 암세포주의 세포사멸과 더불어, 비장세포의 증식은 종양세포 혹은 바이러스 감염세포 등의 내인성 항원에 대하 여 유효한 방어력을 유도할 수 있을 거라 생각되어 본 연구 에서는 숙성별 간장이 비장세포의 증식 미치는 영향도 확인 하였다. 그 결과, M group이 비장세포의 증식을 24시간에서 증가시키는 것을 확인하여 면역증강에도 도움이 될 것으로 확인되었다. 즉, 이러한 결과를 토대로, 각 숙성별 년도에 따 른 항암활성 및 NK cell 활성의 차이는 숙성(발효)되는 과정 중 간장의 유효성분 변화에 따라 효능 차이를 보일 것으로 예상되며 추후 간장의 숙성 별 항암효능을 나타내는 성분변 화 분석도 의미 있을 것으로 생각된다.
