I. 서 론

피부는 신체를 둘러싸고 있는 가장 넓은 면적을 차지하는 기관으로 각종 화학물질과 박테리아, 곰팡이 등의 생물학적 침입을 방어하고 자외선을 포함한 빛으로 부터도 내부기관 을 보호하는 1차 방어기관이라 할 수 있다. 이와 동시에 피 부는 밖으로 보이는 부분으로 미적가치의 척도가 되기도 한 다. 일정 나이를 지나 시간이 지나가게 되면 피부를 구성하 는 구조가 내재적으로 약해지며 생리적 조절 또한 원활해지 지 않게 된다. 또한 미세먼지와 자외선 등의 화학적, 물리적 자극에 지속적으로 노출되면 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성과 제거의 평형이 깨진다. 이로 인해 세 포의 기능 저하와 세포 외 기질의 구성 분자들의 변성으로 피부의 탄력이 떨어지고 주름이 생기며 장벽의 기능 상실로 염증의 증가 등 피부에 다양한 문제가 발생한다(Bocheva et al. 2019, Zouboulis et al. 2019). 따라서 피부에서 항산화, 보습, 미백, 주름 억제, 염증 억제 등의 다양한 기능성을 가 지면서 독성이 없는 화장품에 대한 요구가 높다. 이에 기능 성과 안전성을 가진 추출물 및 물질에 대한 연구가 식물자 원을 중심으로 꾸준히 이뤄져 왔으며 새로운 기능성 원료에 대한 탐색과 산업적 응용에 대한 관심은 대단히 크다 (Baumann 2007, Espinosa-Leal & Garcia-Lara 2019, Mukherjee et al. 2011).

Oenothera속 달맞이꽃의 다양한 생리활성이 보고되고 있다. 달맞이꽃(Oenothera biennis)에서 분리한 Oenotheralanosterol A, B는 macrophage에서 interleukin-6와 tumor necrosis factor-α발현을 억제하며(Singh et al. 2012) 항암과 항균 효 과가 보고되었다(Singh et al. 2017). 애기달맞이꽃(Oenothera laciniata)의 80% 에탄올 추출물과 분획물은 항산화와 항균 효과를 보였으며(Lee et al. 2006, Kim et al. 2007) Oenothera odorata의 잎 추출물은 low density lipoprotein (LDL)의 산화를 억제하였다(Ryu et al. 2002). 피부와 관련 하여 O. laciniata 메탄올 추출물은 인체피부섬유아세포에서 matrix metaloproteinase (MMP)의 발현과 활성을 억제하는 항노화 효과와 melan-a에서 멜라닌 생성을 억제하는 미백효 과를 보였다(Kim et al. 2016, Kim et al. 2017). 큰달맞이 꽃(Oenothera lamarckiana)은 주로 유전학관련 연구의 대상 이었나 생리활성과 관련해서 물 추출물의 항산화 작용과 산 화 스트레스로 자극한 인체피부흑생종세포에서 멜라닌 생성 을 억제하는 미백효능이 보고되어(Oh & Choi 2011) 피부 관련한 기능성이 있음이 알려졌다. 하지만 화장품등에 이용 하기 위한 기능성에 대한 연구는 부족한 상태로 기초적인 O. lamarckiana의 기능성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각하 여 항산화, 효소활성억제, 항균 실험을 진행하였다.

II. 연구 내용 및 방법

1. 실험재료

큰달맞이꽃(Oenothera lamarckiana)의 지상부 추출물은 한 국생명공학연구원의 한국식물추출물은행(Daejeon, Korea)에 서 구매하여 사용하였다. 큰달맞이꽃은 2015년 제주도에서 채집되어 증거표본(KRIB 0084331)이 한국생명공학연구원 식물표본관에 보관되어 있다. 식물을 음지에서 건조하여 분 쇄한 후 분말시료 80 g에 메탄올 1 L를 가한 후 초음파추출 기를 이용하여 상온에서 30회(15분 추출-120분 정지) 반복추 출하였다. 이 후 추출액을 여과한 다음 감압농축하여 추출물 을 얻었다. 추출물을 총페놀성 화합물과 2,2-diphenyl-1- picryl hydrazyl (DPPH) radical scavenging 측정을 위해서 는 메탄올로 5 mg/mL, 효소저해활성과 항균효과를 위해서는 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 20 mg/mL로 녹여 −20°C에 보관하면서 stock solution으로 사용하였다.

2. Total phenolic compounds 측정

총폴리페놀 화합물 함량은 folin-denis 방법을 변형하여 측 정하였다. 큰달맞이꽃 추출물을 1 mg/mL 농도로 메탄올에 희석 시킨 후 150 μL와 folin-ciocalteu’s phenol reagent 150 μL를 혼합하여 5분간 반응시켰다. 20% Na₂CO₃ 150 μL를 넣어 30분 반응시킨 다음 증류수 1000 μL를 넣어주었 다. 8000 rpm에서 30초간 원심분리한 후 200 μL를 취하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid (62.5 μg/mL ~500 μg/m)를 이용한 검량선을 작성하여 총 폴리페놀 화합 물 함량을 계산하였다.

3. DPPH radical scavenging 측정

메탄올에 녹인 시료 100 μL에 메탄올에 250 μM 농도로 녹인 DPPH 100 μL를 혼합하였다. 빛을 차단한 상태에서 10 분간 방치한 후 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으 로 시료 대신 메탄올을 넣어 주었으며 양성대조군으로 ascorbic acid (75 μg/mL)를 사용하였다. DPPH 소거율은 다 음과 같이 구하였다.

4. in vitro L-dopa oxidation assay

L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase의 활성을 확인하였다. 0.1M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 150 μL에 2 mM L-dopa (67 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8) 20 μL, 시료 10 μL, tyrosinase (1,000 U/mL) 20 μL를 순서대로 넣 고 37°C에서 빛을 차단한 상태에서 30분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 시료를 녹일 때 사 용한 DMSO 10 μL를 넣어주었으며 모든 군에서 DMSO의 최종 농도를 2.5%로 맞추었다. 양성 대조군으로 kojic acid (25 μg/mL)을 사용하였으며 저해율은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

5. Elastase assay

96 well plate에 큰달맞이꽃 추출물 시료 10 μL와 elastase 기질 N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide (1.0 mM in 0.1M Tris-Cl buffer, pH8.0)를 130 μL를 넣고 25°C에서 5분간 방 치하였다. Elastase (0.1 U/mL in 0.1M Tris-Cl buffer, pH8.0)를 10 μL를 첨가한 후 25°C에서 30분간 방치 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든군에서 DMSO의 최종농 도는 5%로 맞추었다. 양성대조군으로 ursolic acid를 사용하 였다. 저해율은 위 tyrosinase 저해율 계산방법과 동일하다.

6. Paper-disc assay

본 실험에 사용한 표준균주정보는 <Table 1>과 같다. 한천 배지(Becton-Dickinson, NJ, USA)에 세균을 도말한 후 37°C에서 18시간 배양하였다. 배양된 세균의 집락 3~5개를 채취하여 멸균 생리식염수로 옮겨 각각의 균수를 McFarland 탁도 0.5 (1.5×10⁸/mL)를 맞추어 세균 부유액을 준비하였다. 멸균된 면봉을 세균 부유액 내에 잠기도록 한 후 꺼내어 Mueller-Hinton (MH) 평판배지 표면에 3회 반복하여 도말하 였다. DMSO에 녹인 20 mg/mL과 동일 용매로 희석한 2 mg/mL 10 μL를 paper disc (6 mm)에 처리 한 후 건조하여 용매를 제거하였다. 대조군으로 DMSO 10 μL를 paper disc 에 처리 하여 건조한 것을 사용하였다. Paper disc를 세균을 도말한 평판배지 위에 올려놓고 밀착시켰다. 37°C에서 18시 간 동안 배양한 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone)의 지름을 측정하였다.

7. 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 측정

균들을 각각의 배양 배지와 조건에서 배양한 후, 세균의 집락을 취하여 각각의 균수를 최종 5×10⁵/mL이 되도록 MH 액체 배지(Becton-Dickinson)에 세균 부유액을 준비하였다. 큰달맞이꽃 추출물은 최소 농도 0.13 mg/mL에서 최대 농도 2 mg/mL의 범위 내에서 MH 액체 배지에 단계 희석하였다. 대조군과 각 실험군에 동일한 최종 용매의 농도(%)가 되도 록 DMSO를 첨가하였다. 부유액을 100 μL, 농도별 추출물 을 96 well plate에 각각 100 μL씩 접종하였다. 37°C에서 18시간 배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 균의 저 해가 일어나는 최소값을 최소저해농도(MIC)로 결정하였다.

8. 통계처리

측정값은 독립적으로 이루어진 3회의 실험에서 얻은 값을 mean±SD로 나타내었다. 시료들 간의 통계분석은 Prism 6 (GraphPad Sofware Inc., SanDiego, USA)을 이용하여 일원 분산분석과 Tukey’s honestly significant difference test로 이뤄졌다(p<0.05).

III. 결과 및 고찰

1. O. lamarckiana 추출물의 DPPH 소거 효과

O. lamarckiana 지상부 추출물의 총페놀성물질의 량은 229.35 mg TAE (tannic acid equivalent)/g이었다. Oenothera 속 달맞이꽃의 총페놀성물질의 함량에 대해서는 여러 논문 에서 보고된 바 있다. O. laciniata 전초의 80% 에탄올 추출 물에서 63.96 mg TAE/g의 함량(Lee et al. 2006)이, 100% 메탄올 추출물에서는 66.3 mg TAE/g의 함량이 보고되었다 (Kim et al. 2017). O. biennis 씨의 80% 메탄올 추출물에서 는 35.82 mg GAE (gallic aicd equivalent)/g이었으며(Moon et al. 2017) O. larmarckiana 잎의 70% 아세톤 추출액에서 는 185 mg TAE (tannic acid equivalent)/g이었다(Bhatta et al. 2013). 한정된 정보에서 Oenothera속 달맞이꽃은 뿌리, 씨 보다 잎이나 줄기의 지상부에 좀 더 총페놀성물질 함량 이 높은 것으로 생각된다. Timoszuk et al.은 O. biennis의 지상부는 주로 페놀성물질과 플라보노이드를 가지고 있으며 씨의 경우에는 lipid가 주요한 구성성분임을 밝히고 있다 (Timoszuk et al. 2018). O. lamarckiana 지상부 추출물 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL 농도에서 DPPH radical의 소거 효과를 실험하였다. 각 농도군에서 DPPH 소거율은 18.79, 36.11, 65.88, 83.99, 86.46%로 농도 의존적으로 DPPH radical이 소거됨을 확인하였다(Fig. 1). 양성대조군으 로 사용한 ascorbic acid (75 μg/mL)는 87.85%를 보였다. 각각의 농도에서의 소거율로 계산한 SC₅₀의 값은 8.52 μg/ mL이었다<Figure 1>. O. laciniata 전초의 80% 에탄올 추 출물의 DPPH에 대한 SC₅₀ 값은 44.21 μg/mL이었다(Lee et al. 2006). 페놀성 물질만이 DPPH 소거능을 보이는 것이 아 니고 페놀성 물질들도 개별 물질들이 갖고 있는 DPPH 소거 능이 다르게 때문에 단언 할 수는 없어도 총페놀성물질 함 량과 DPPH의 소거능사이에 관련성이 크다는 보고들이 있다 (Zhang et al. 2017, Lee et al. 2012). O. laciniata 전초의 80% 에탄올 추출물과 O. lamarckiana 지상부 추출물의 총페 놀성물질 함량과 DPPH SC₅₀ (50% scavenging concentration) 을 비교했을 때 Oenothera속 달맞이꽃에서 페놀성물질 함량 과 DPPH 소거능은 일정 비례관계가 있을 것으로 생각한다.

2. O. lamarckiana 추출물의 tyrosinase와 elastase 활성 억 제 효과

Tyrosinase는 tyrosine 혹은 L-dopa를 기질로 하여 hydroxylation 시키는 효소로 melanin 생성에 매우 중요한 효소이기 때문 에 일반적으로 melanin 생성을 억제하는 약물을 탐색하기 위 해 tyrosinase 활성 억제 효과가 있는지 screening한다. Elastin은 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)을 구성하는 단백질의 하나로 UVB의 자극과 염증으로 인한 elastase에 의해 분해가 일어나면 주름이 발생하게 되어서 elastase의 활 성을 억제하는 추출물과 물질들을 탐색하는 연구가 활발하 다(Kwak et al. 2005, Tundis et al. 2015). O. lamarckiana 의 미백효과와 항노화 효과를 갖는지 알아보기 위해 O. lamarckiana 지상부 추출물 31.25, 62.5, 125, 250, 500 μg/ mL 농도에서 tyrosinase와 elastase의 활성 저해 효과를 확인 하였다. Tyrosinase의 경우 각 처리농도에서 저해율은 6.08, 17.59, 29.43, 43.44, 63.29%로 농도 의존적으로 tyrosinase 의 활성을 억제함을 확인하였다. 양성대조군으로 사용한 kojic acid (25 μg/mL)는 80.49%를 나타내었다. 각 실험군에서의 효소저해율로 계산한 tyrosinase에 대한 IC₅₀은 307.94 μg/ mL이었다. Elastase의 경우 각 처리농도에서 저해율은 9.68, 21.05, 46.51, 60.19, 69.72%로 처리 농도를 증가할수록 효 소의 활성 저해가 강해졌다. 각 실험군에서의 효소저해율로 계산한 elastase에 대한 IC₅₀ (half-maximal inhibitory concentration) 은 181.51 μg/mL이었다. 기능성 피부활성 효능이 뛰어나다 고 알려진 epigallocatechin gallate (EGCG)를 함유하는 녹 차 열수 추출물의 mushroom tyrosinase에 대한 IC₅₀은 144 μg/mL로 O. lamarckiana의 메탄올 추출물이 효능이 낮았다 (Sim et al. 2018). 하지만 elastase에 대한 녹차 열수 추출물 의 IC₅₀은 1 mg/mL이 넘는 것으로 보고되어 elastase에 대해 서는 O. lamarckiana 메탄올 추출물의 효과가 좋은 것으로 보인다(Oh et al. 2018). 본 연구에 사용한 O. lamarckiana 는 제주도에서 채집된 것으로 제주 자생식물들을 고압용매 로 추출하여 측정한 tyrosinase와 elastase 저해효과와 비교해 보았다. 자금우가 가장 낮은 802 ppm의 IC₅₀를 보였는데 이 는 O. lamarckiana 추출물보다는 높은 수치로 O. lamarckiana 가 좋은 효과를 보이는 것으로 보인다. 하지만 elastase에 대 해서 자금우는 66 ppm의 IC₅₀을 보여 O. lamarckiana 추출 물보다는 효과가 좋았다(Hyun et al. 2007). 이미 O. lamarckiana 추출물이 oxidative stress에 의한 멜라닌 생성억 제효과가 있으며 같은 속의 O. laciniata 추출물의 경우 또 다른 ECM 분해 효소인 matrix metalloproteinase (MMP)-1 의 발현을 억제하는 항노화 효과가 있음이 보고되었다. 본 연구에서 tyrosinase와 elastase 억제 효과를 보인 O. lamarckiana 추출물의 향후 미백과 항노화 효과에 대한 추가적 연구가 필 요해 보이며 준비 중에 있다. Fig. 2

3. O. lamarckiana 추출물의 피부 관련 항균효과

Staphylococcus epidermidis는 피부에 상주하는 그람양성박 테리아로 피부장벽에 문제가 생기면 피부에 염증을 발생시 키는 기회균으로 피부 관련 기능성을 확인하기 위해 사용하 는 대표적인 균주이다. Pseudomonas aeruginosa는 그람음성 박테리아로 화장품을 오염시켜 화장품의 상품성과 안전성을 저하시키는 균으로 화장품의 장기보존을 위한 보존제에 대 한 연구에서 항균성 측정에 대상이 되는 균이다(Lee et al. 2018, Park et al. 2016). O. lamarckiana 추출물을 paper disc 방법으로 S. epidermidis와 P. aeruginosa에 대한 항균 효과를 알아보았다. S. epidermidis에 대해 20과 200 μg/disc 에서 clear zone의 지름이 각각 8과 15 mm로 나타났으며 P. aeruginosa에 대해서는 해당 처리농도에서 clear zone이 나 타나지 않았다. 최소저해농도를 확인하기 위해 broth dilution assay를 실시했을 때 S. epidermidis에 대해서는 125 μg/mL 에서 다소 생존율이 감소했고 250 μg/mL에서 급격히 떨어졌 다. 흥미롭게도 P. aeruginosa의 경우에는 paper disc에서 20, 200 μg/disc 에서 clear zone을 보이지 않았으나 2 mg/ mL까지 농도 의존적으로 생존이 줄어드는 양상을 보였다. 본 연구에서는 피부상재균으로 염증을 일으킬 수 있는 S. epidermidis와 화장품 오염의 원인이 되는 P. aeruginosa를 대상으로 하여 항균 효과를 확인할 수 있어 O. lamarckiana 추출물이 염증 억제 및 화장품 보존제로서 이용가능성이 있 을 것으로 생각한다. Oenothera속에 속하는 다른 종의 추출 물이 S. epidermidis에 대한 항균효과를 본 보고는 찾을 수 없었다. 하지만 다른 박테리아에 대한 항균효과는 보고된 바 있다. O. laciniata 전초 에틸아세테이드 분획물의 S. aureus 에 대한 MIC가 10 μg/mL이었으며 O. biennis 70% 에탄올 추출물은 Bacillus cereus에 대해 성장억제 효과를 보였다 (Kim et al. 2007, Kim & Lee 2016). Oenothera속에 속한 종들간의 항균효과가 다르게 나타날 수 있지만 위와 같은 항 균효과를 보인다는 점에서 다른 피부상재균이나 식품 오염 과 관련된 박테리아들에 대해 항균 효과를 가질 수 있다고 생각하여 이에 대한 연구를 계획하고 있다. Fig. 3, Table 2

IV. 요약 및 결론

Oenothera속 달맞이꽃 중 O. lamarckiana 지상부의 메탄 올 추출물을 한국식물추출물은행에서 구입하여 피부와 관련 된 생리활성을 실험하여 화장품 등에 이용할 수 있는 가능 성을 확인하고자 하였다. O. lamarckiana 지상부 메탄올 추 출물의 총페놀성물질의 함량은 229.35 mg TAE (tannic acid equivalent)/g었고 DPPH에 대한 SC₅₀은 8.52 μg/mL으로 상 대적으로 높은 총페놀성물질함량과 항산화 효과가 있었다. Tyrosinase와 elastase 활성 억제에 대한 IC₅₀은 각각 307.94 과 181.51 μg/mL을 보여 멜라닌 생성 억제와 주름생성 억제 가 있을 것으로 예상한다. 항균효과와 관련하여 피부 염증의 원인이 될 수 있는 S. epidermidis에 대해 20과 200 μg/disc paper disc assay에서 각각 지름 8과 15 mm의 clear zone을 보였으며 250 μg/mL의 최소저해농도를 보여 피부상재균에 대한 항균 효과를 보였으며 P. aeruginosa에 대해서는 paper disc에서 항균효과를 확인할 수 없었으나 최소저해농도측정 실험에서는 2 mg/mL까지 농도의존적으로 저해하는 효과를 보여 화장품 보존제로서 이용 가능성을 보였다. 추후 실험으 로 미백 및 노화 관련된 실험이 좀 더 진행 되어야 할 것으 로 보이며 다른 Oenothera속 식물, 부위별, 추출방법별 기능 성 비교와 효능물질에 대한 연구 또한 필요할 것으로 보인다.