I.서 론

최근 서구화된 식습관 및 식문화 환경 변화로 운동부족과 영영과다, 흡연, 음주 등 건강을 위험 하는 요인들에 의해 생 성되는 만성질환이 계속해서 증가함에 따라 건강 증진 및 질 병 예방을 충족시킬 수 있는 건강기능성 식품 소재에 대한 관심이 증가되고 있다(Park et al. 2004).

생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환을 유도하는 자 유라디칼은 산화적 스트레스를 유발하게 되며, 이러한 산화 적 스트레스는 세포막을 손상시키고 단백질, 지질, 탄수화물 및 DNA와 반응하여 여러 조직의 세포를 손상시켜 뇌졸중, 암, 신경장애 등 다양한 질병이 발생하는 것으로 알려져 있 다(Ames 1993). 특히 산화적 스트레스에 의한 지질 과산화가 퇴행성 신경질환의 대부분을 차지하는 Alzheimer’s disease (AD)을 유발시킨다는 연구들이 보고되고 있다(Ames et al. 1993). 최근에 개발된 퇴행성 신경질환의 치료법인 외과적 수술, 세포이식 및 항산화제 처리 등 다양한 치료법은 부작 용 및 뇌조직의 손상 등을 초래함으로써 여러 가지 위험부 담을 안고 있으므로 항산화성을 기반으로 한 신경세포 보호 효과가 뛰어나고 안정성이 입증된 천연소재의 개발이 요구 되고 있다(Yoon et al., 2007).

정향은(Eugenia caryophyllata Thunb.)은 상록 소교목의 꽃봉오리를 건조한 것으로 도금양과(Myrtaceae)에 속한다. 정 향은 오래전부터 서양요리에서 각종 육류와 야채요리를 만 들 때 이용되어져 왔으며, 국내에서는 방충제, 곰팡이 방제 목적과 향미강화 및 나쁜 향미 억제 등 목적으로 이용되는 것으로 보고되고 있다(Singh et al. 2009). 현재까지 정향 추 출물에 관한 연구로 항산화효과, 항염증효과(Oztuurk et al. 2005), 항균효과(Wang et al. 2010 ) 등의 많은 연구들이 보 고되고 있다. 한편 정향의 추출방법과 추출조건 등에 따라 정향의 항산화 효과에 대한 연구결과들이 다소 다르게 보고 되고 있다(Lee & Yoon. 1993; Ahnet al. 2000; Dong et al. 2004; Oh 2016). 따라서 추출조건에 따른 정향의 항산화 효과와 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과에 대한 과학적 연구가 필요한 실정이다.

본 연구에서는 정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물의 diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH), azino-bis diammonium salt (ABTS) 및 superoxide dismutase (SOD) 유사활성과 같은 항산화 효과를 비교하고 MTT assays를 활용한 신경세포 보 호효과를 측정하여 Alzheimer’s disease (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환에 대한 정향의 활용가능성을 제시하고자 하였다.

II.연구 내용 및 방법

1.실험 재료 및 추출물의 제조

본 실험에 사용한 시료는 서울 경동시장에서 판매하는 인 도네시아산 정향(Eugenia caryophyllata Thunb.)을 2016년에 구입하여 냉동고에 보관하면서 추출용 시료로 분석하는데 사 용하였다. 시료의 열수 추출물은 정향 100 g에 증류수 1,000 mL을 첨가하고, 90°C로 12시간 동안 가열 환류하면서 3회 추출하였다. 시료의 메탄올 추출물은 정향 100 g에 메탄올 1,000 mL을 첨가하여 실온에서 6시간씩 3회 추출하였다. 열 수 및 메탄올 추출물은 No. 2. 여과지(Advance Co., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 그 후 40°C 수욕 상에서 진공회전농축 기(N-1000S-W, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압·농축한 다 음 동결건조(Bondiro Vacuum Freeze-Dryer, Ilshin Lab Co., Ltd, Seoul, Korea)하여, −70°C에 냉동고에서 보관하면 서 본 실험에 사용하였다.

2.총 polyphenol 함량

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물 1 mL와 Folin reagent 2 mL을 가한 후 실온에서 3분 동안 반응시키고 10% Na₂CO₃ 2 mL을 혼합 한 후 30°C에서 40분간 정치하 였다. 흡광도는 760 nm에서 UV-visible spectrophotometer (UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하 였다(Folin-Denis, 1912). 표준곡선은 tannic acid (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, USA)로 작성한 검량선으로부터 총 polyphenol 화합물의 함량을 구하였다.

3.DPPH radical 소거활성

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물 1 mL에 0.2 mM 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 1 mL을 가한 후 균일하 게 교반한 다음 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 517 nm에 서 UV-spectrophotometer (UV-1601PC, Shimadzu, Japan) 를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Blois, 1958). DPPH radical 소거활성은 (1−시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광 도)×100에 의하여 산출하였다.

4.ABTS radical 소거활성

시료의 각 농도별 용액 0.5 mL와 희석한 7.4 mM 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 용액 0.5 mL를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 735 nm에서 UV-spectrophotometer (UV-1601PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Roberta et al. 1999). ABTS radical 소거활성은 (1−시료첨가구의 흡광도/무 첨가구의 흡광도)×100에 의하여 계산하여 나타냈다.

5.SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity)

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물 용액 40 μL에 Tris- HCl buffer (50 mM tris amino-methane, 10 mM EDTA, pH 8.0) 120 μL와 7.2 mM pyrogallol 20 μL을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨다. 1 N HCl 20 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 420 nm에서 UV-spectrophotometer (UV-1601PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정 하였다(Marklund & Marklund, 1974). SOD 유사활성은 (1−시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100에 의하여 계산하여 나타냈다.

6.신경세포 보호효과 측정

Hydrogen peroxide (H₂O₂)으로부터 유도된 SH-SY5Y 세 포 생존율에 대한 효과는 MTT reduction assay로 측정하였 다(Heo et al. 2001). 정향 열수와 메탄올 추출물을 농도별로 SH-SY5Y 세포에 H₂O₂ 처리하기 1시간 전에 처리하고, 100 μM H₂O₂를 각각 24시간동안 처리하였다. 이 상태의 SHSY5Y cell에 MTT stock solution을 처리하여 37°C에서 3 시간 incubation한 다음, DMSO 100 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 570 nm에서 microplate reader (UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구는 200 μM 비타민 C를 사용하였고, cell viability는 대조군에 대한 % 농도로 나타냈다.

8.통계처리

모든 통계자료는 3회 반복 실시하여 얻은 결과로, 실험결 과의 통계 분석은 SPSS Win. 20.0을 사용하였다. 각 시료에 대한 값은 mean±SD로 나타내었으며 실험군 간의 차이 유의 성을 일원배치 분산분석(One way ANOVA)를 실시하였고, 시료 간의 유의적인 차이는 Duncan’s multiple range test와 t-test를 이용하여 사후 검증을 실시하였다.

III.결과 및 고찰

1.총 polyphenol 함량

정향 열수 및 메탄올 추출물의 총 polyphenol 함량을 측정 한 결과는 Table 1과 같다. 정향 열수 및 메탄올 추출물의 총 polyphenol 함량은 각각 286.39 mg/g와 531.62 mg/g으로, 메탄올 추출물은 열수 추출물에 비해 총 polyphenol 함량이 유의적으로 더 높게 나타났다(p<0.05). Oh (2016)의 연구에 서 정향 열수 추출물에서 총 phenol성 화합물 함량이 239.26 mg/g으로 나타났다고 보고되어, 본 연구와 비교 하였을 때 유사한 것으로 나타났다. 또한, Dong et al.(2004) 연구결과 에서 정향 물과 메탄올 추출물에서 총 phenol성 물질 함량은 23.1%와 42.8%을 함유하고 있는 것으로 보고되어, 본 연구 결과의 정향 메탄올 추출물에서 총 polyphenol 함량이 더 높 게 나온 결과와 유사하게 나타났다.

2.DPPH radical 소거활성

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물을 이용하여 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 모든 처 리구에서 추출물 농도가 증가함에 따라 소거활성이 증가하 는 경향을 보였다(p<0.05). 6~50 μg/mL의 농도에서 정향 메 탄올 추출물의 경우 열수 추출물 보다 DPPH radical 소거능 은 유의적으로 높게 나타났으나(p<0.05), 100 μg/mL와 200 μg/mL의 농도에서는 열수 추출물의 항산화 활성은 대조군으 로 사용한 비타민 C와 유의적인 차이를 보이지 않았다. Dong et al.(2004)은 정향을 물, 메탄올 및 에테르로 추출하 여 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과, 각각 36.1, 30.9, 29.7%로 물 추출물에서 자유라다칼 소거능이 가장 높았다고 보고하였으며, 이는 본 연구 결과에서의 정향 열수 추출물이 메탄올 추출물에 비해 DPPH radical 소거능이 증가한 결과 와 유사한 경향을 보였다.

3.ABTS radical 소거활성 및 SOD 유사활성

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물의 ABTS radical 소거 활성과 SOD 유사활성을 측정한 결과는Table 3과 Table 4와 같다. 정향 열수 및 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS radical 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나 타냈다(p<0.05). 100~400 μg/mL의 농도에서 정향 메탄올 추출물의 경우 대조군으로 사용한 비타민 C에 비해 유의적 으로 높게 나타났으나(p<0.05), 800~1000 μg/mL의 농도에 서는 정향 열수 및 메탄올 추출물은 비타민 C와 유사한 항 산화 활성을 나타내었다.

SOD 유사활성은 정향 열수 및 메탄올 추출물 농도가 증 가함에 따라 유의적으로 농도 의존적으로 증가하는 것을 확 인하였다(p<0.05). 농도 100~400 μg/mL에서 메탄올 추출물 은 열수 추출물에 비해 SOD 유사활성은 유의적으로 높았으 나, 대조군인 비타민 C에 비해서는 낮은 활성을 보였다 (p<0.05). 농도 800~1000 μg/mL에서 메탄올 추출물은 80.33 %와 83.26%의 높은 소거능을 나타내었으며(p<0.05), 대조군 인 비타민 C와 유의적인 차이를 보이지 않았다.

인체 내 생성된 자유라디칼을 환원시키거나 소거하는 능 력은 체내의 항산화 활성을 예측할 수 있고, 이러한 자유라 디칼 소거작용은 인체의 노화와 질병을 예방하는데 도움이 된다. 항산화 활성을 측정하는 방법의 일종인 ABTS radical 소거활성은 극성과 비극성 시료의 소거활성을 모두 측정할 수 있으므로 DPPH radical 소거활성과는 달리 광범위하게 사용하는 것으로 보고되고 있다(Van et al. 1999). Jeong et al.(2010)의 보고에 의하면, 어성초 60% 메탄올 추출물의 농 도가 증가함에 따라 ABTS radical 소거활성이 높아지는 경 향을 보였으며, 이는 어성초 메탄올 추출물이 phenol성 화합 물과 같은 비교적 극성이 높은 화합물을 다량 함유하고 있 어 자유라디칼을 우수하게 소거하는 것으로 알려져 있다.

Superoxide dismutase (SOD) 유사 활성은 활성산소 종을 hydrogen peroxide (H₂O₂)로 전환하는 반응을 촉매작용을 하 는 pyrogallol 생성량을 측정하여 활성산소에 대한 산화 억 제 효과를 측정할 수 있는 방법이다(Benzie et al. 1996). SOD 유사활성 물질은 SOD와 결합된 phenol계 물질로 superoxide에 대한 산화 억제 효과가 있는 것으로 밝혀져 있 다(Nice et al. 1995). Choi et al.(2012)은 와송을 메탄올과 물로 추출하여 SOD 유사활성을 측정한 결과 1 mg/mL 농도 에서 각각 38.9%와 32.5%으로 메탄올 추출물이 물 추출물 에 비해 자유라다칼을 우수하게 소거하는 것으로 보고하여 본 연구결과와 유사한 것으로 나타났다. 본 실험 결과에서 정향 열수 추출물에 비해 비극성 용매인 메탄올 추출물에서 의 총 polyphenol 함량 증가는 항산화 활성이 증가하는 것으 로 사료된다.

4.신경세포 보호효과

정향 농도별 열수 및 메탄올 추출물이 H₂O₂에 의해 유도 된 산화적 스트레스로부터 SH-SY5Y 세포 생존율을 측정한 결과는 <Figure 1>과 <Figure 2>와 같다. Neuronal cell viability는 H₂O₂를 처리한 처리구에서 대조구(100%) 대비 60.4%의 생존율을 나타냈고, H₂O₂와 비타민 C를 동시에 처 리한 처리구에서는 81.78%의 생존율로 H₂O₂ 대비 21.38% 정도의 신경세포 보호효과를 나타내었다. 정향 열수 추출물 을 처리한 시료에서는 50 ppm과 100 ppm 농도에서 비타민 C 200 μM와 유의적으로 유사한 신경세포 보호효과를 보였 으며, 농도 10 ppm에 비해 유의적으로 높게 나타났다 (p<0.05). 정향 메탄올 추출물을 처리한 시료에서는 100 ppm 농도에서 비타민 C 200 μM와 유의적으로 유사한 신경세포 보호효과를 보였으며, 10 ppm과 50 ppm 농도에 비해 유의적 으로 높게 나타났다(p<0.05). Jeong et al.(2010) 연구에 의 하면, 어성초 60% 메탄올 추출물에 함유되어 있는 다양한 phenol성 화합물으로 인해 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트 레스로부터 신경세포 보호효과가 나타난 것으로 보고하였다. 이는 본 연구 결과에서 정향 열수 및 메탄올 추출물에 함유 되어 있는 phenol성 화합물에 의해 과산화수소로부터 유도 된 손상으로부터 신경세포를 보호하여 세포생존율을 증가한 것으로 사료된다.

뇌 신경세포막은 불포화지방산을 매우 많이 함유하고 있 으며, 뇌 신경세포막에서의 지방 산화는 다른 조직에 비해 산화적 손상이 비정상적으로 매우 민감하므로 세포사멸을 일 으키는 원인으로 알려져 있다. Zhao et al.(2009)의 연구결과 에 의하면 Alzheimer disease (AD)와 같은 신경계 질환은 산화적 스트레스로부터 신경세포의 손상에 의해 발생되며, flavonoids, polyphenols 등의 항산화 활성을 갖는 성분들은 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하여 세포 생존율을 높여주는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서도 정향 열수와 메탄올을 통해 추출된 phenol성 화합물이 과산화수소로부터 유도되는 손상으로부터 뇌 신경세포를 보호하여 세포생존율 을 높여 주는 것으로 사료된다.

IV.요약 및 결론

본 연구는 정향 열수 및 메탄올 추출물의 농도별 항산화 활성 및 신경세포 보호효과를 비교함으로써 추출용매에 따 른 정향의 항산화 활성 및 신경세포 보호효과에 미치는 영 향을 검토하고자 실시하였다. 메탄올 추출물의 총 polyphenol 함량은 열수 추출물에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 정향 열수 및 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거능은 농도 의존적인 경향을 보였으며, 특히 100 μg/mL와 200 μg/mL의 농도에서 정향 열수 추출물은 비타민 C와 유사한 소거능력을 보였다. ABTS radical 소거활성과 SOD 유사활성도 결과 농도 의존적인 경향이 나타났다. 800~ 1000 μg/mL의 농도에서 정향 열수 및 메탄올 추출물은 비 타민 C와 유사한 ABTS radical 소거활성 활성을 나타내었 다. 정향 메탄올 추출물은 800~1000 μg/mL의 농도에서 SOD 유사활성이 비타민 C와 유사한 경향을 나타내었다. 정 향 열수 추출물 50 ppm과 100 ppm 농도에서 대조군인 비 타민 C와 유의적으로 유사한 신경세포 보호효과를 나타내었 다. 정향 메탄올 추출물 100 ppm 농도에서 대조군인 비타민 C와 유의적으로 유사한 신경세포 보호효과를 나타내었다. 본 연구 결과를 통하여 phenol성 화합물을 함유한 정향 열수 추 출물과 메탄올 추출물은 항산화 및 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내어 퇴행성 신경질환 예방에 유 용한 건강기능성 식품 소재가 될 것으로 사료된다.