I.서 론

장류는 옛날부터 한국, 중국, 일본 등 아시아에서 가공하 여 이용해온 발효 식품으로 콩을 발효시키고 식염을 가미한 다는 점에서는 비슷하지만 발효에 관한 미생물, 숙성과정, 전 분질원료의 혼합여부, 기타 식염 첨가량 등이 국가나 지역마 다 달라서 각각 독특한 제품으로 전해 내려져 오고 있다(In 2004).

그 중 청국장은 Bacillus subtilis를 증자한 대두에 접종하 여 발효 숙성시킨 것으로 단백질의 소화와 흡수가 용이하고 특유의 점질감과 구수한 풍미를 지니고 있는 우리나라 전통 발효식품으로 정장작용과 혈전용해작용 등 우수한 생리활성 기능들이 알려져 있다(Lee et al. 1992). 청국장은 다른 장류 와 달리 발효시간이 2~3일로 짧으며, 그 후에 소금이나 고춧 가루 등의 부가적인 재료를 이용하여 저장한다(Ahn et al. 2006). 또한 청국장은 쌀을 주식으로 하는 동양인들에게 부 족할 수 있는 단백질의 공급원으로 영양적으로나 경제적으 로 가장 효과적인 한국 전통발효식품이다(Tamang 2015).

렌틸콩은 볼록한 렌즈와 모양이 흡사하다고 하여 ‘렌즈콩’ 이라고도 불리며, 우리나라에서는 ‘까치콩’, ‘나물콩’, ‘제비 콩’ 등의 이름으로 불린다. 렌틸콩은 그 색상에 따라 붉은색, 노란색, 초록색, 갈색, 회색, 검은색 등으로 구분되며, 종종 반점이 나타나는 경우도 있다(Yang & Hong 2014). 렌틸콩 의 일반적인 조성으로 탄수화물 27~63%, 단백질이 20~30%, 식이섬유가 4~35%, 그 외 칼륨, 엽산, 철분, 아연, 마그네슘 등 다양한 무기질들이 풍부하게 함유되어 있다(Min & Shin 2015). 이러한 영양소로부터 항당뇨, 혈전분해, 항암, 항종양, 항산화 효과, 신장결석의 형성 방지 등의 효과가 알려져 있 다(Amarakoon et al. 2012). 특히 렌틸콩을 발효시켰을 때 항산화능 향상, 혈전용해능 향상, GABA함량 증가, 혈압상 승 억제 작용 등이 보고되었다(Torino et al. 2013).현대인의 식사형태가 서구화되어 만성질환의 발병률이 높아짐에 따라 만성질환의 예방과 치료에 대한 관심이 증가하고 식품을 통 해 예방하고자 한다(Yang & Kim 2013). 이러한 식품들 중 발효식품은 유용 미생물에 의해 발효되어 소화에도 좋고, 유 기산 등이 생성 되어 병원성균의 성장을 억제하며, 발효산물 들이 항산화, 항비만, 항암, 항돌연변이 및 면역증강 효과를 가진다(Lee et al. 2011). 본 연구의 목적은 Choi(2015)가 재래간장으로부터 분리한 4가지 Bacillus subtilis를 이용하여 렌틸콩 청국장을 제조하고 발효과정에서 이화학적 특성과 항 산화능을 측정하여 렌틸콩 청국장 제조에 최적의 발효시간 을 파악하고자 한다. 그리고 최적의 발효시간으로 제조한 렌 틸콩 청국장의 관능검사를 실시하여 렌틸콩 청국장 발효에 적합한 starter를 얻고자 한다.

II.연구내용 및 방법

1.실험재료

본 실험에 사용한 렌틸콩(Lens culinaris Med.)은 호주산 브라운 렌틸콩으로 (주)인더스트리(Seoul, Korea)에서 구입하 여 냉장(4°C)보관 하여 사용하였다.

2.균주

본 실험에 사용한 균주는 Choi(2016)가 재래간장으로부터 분리한 균주를 사용하였다. 재래 간장으로부터 분리한 균주 는 16S rDNA sequence 분석 한 결과 Bacillus subtilis strain HB9 (S1), Bacillus subtilis strain HDXJ01 (S2), Bacillus subtilis strain S12 (S3), Bacillus subtilis strain J-18 (S4)이었다. 각각의 Bacillus subtilis는 Luria Bertani (LB) broth에 접종하여 37°C에 24시간 배양하여 starter로 사 용하였다.

3.렌틸콩 청국장 제조

렌틸콩을 흐르는 물에 3회 수세한 후 3배의 물을 가하여 4°C에서 15시간 수침시켰다. 불린 렌틸콩을 찜기에서 1시간 증자하고, 10분간 뜸을 들인 후 60°C까지 냉각하였다. 증자 한 렌틸콩은 각각의 바구니에 담아 Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4 균주를 10⁷ 기준으로 100 g당 1.67 mL씩 접종하였 다. 청국장은 37°C에서 0, 24, 48, 72시간 발효시킨 후 −70 °C에 저장하면서 시료로 사용하였다.

4.Bacillus 생균수

10 g의 청국장과 90 mL의 멸균식염수(0.09% NaCl)를 sterilized bag (Huko FS Co., Korea)에 넣고 stomacher (Seward Co., UK)를 이용하여 260 rpm으로 30초간 마쇄하 였다. 마쇄액 1 mL를 9 mL의 멸균식염수에 순차적으로 희 석하였다. 희석된 마쇄액 0.1 mL를 Bacillus 선택배지인 dextrose tryptone agar (BD Difco, USA)에 도말하고 50°C 에서 72시간동안 배양 후 colony를 계수하였다.

5.pH

청국장 5 g에 증류수 45 mL를 가하고 1분간 균질화 시키 면서 pH meter (Thermo orion, USA)로 측정하였다.

6.환원당

환원당 정량은 DNS법으로 측정하였다(Miller 1959). 시료 10 g에 증류수 100 mL를 가하여 30분간 진탕추출시킨 후 여 과지(Whatman No. 2)로 여과해 시료액을 제조하였다. 시료 액 1 mL에 dinitrosalicylic acid (DNS) 3 mL를 첨가하여 5 분간 중탕한 후, 5분간 냉각하고 분광광도계(UV-2101, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7.아미노태 질소

아미노태 질소는 formalin titration method (Codex 2015) 에 의해 측정하였다. 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 sterilized bag (Huko FS Co., Korea)에 넣고 stomacher (Seward Co., UK)로 30초간 260 rpm에서 균질화 시킨 후 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 여과액에 증류수를 가하 여 250 mL로 정용하였다. 본 시험은 시료액 25 mL와 중성 formalin 용액 20 mL, 증류수 20 mL를 교반하여 0.1 N NaOH로 pH 8.4가 돨 때까지 적정하였다. 공시험은 중성 formalin 용액 20 mL 대신 증류수 20 mL를 가하여 본 시험 과 같은 방법으로 측정하였다.

8.암모니아태 질소

암모니아태 질소는 Chae(2006)의 방법에 의해 측정하였다. 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 sterilized bag (Huko FS Co., Korea)에 넣고 stomacher(Seward Co., UK)로 30 초간 260 rpm에서 균질화 시킨 후 여과지(Whatman No. 2) 로 여과한 여과액에 증류수를 가하여 200 mL로 정용하였다. 시료액 200 mL에 10% KOH용액 50 mL를 가한 후 소포제 로 ethanol 100 mL를 첨가 하였다. 킬달증류기(Chang Shin Sci. Co., Korea)를 이용하여 80°C에서 30분간 증류한 후 암 모니아 기체가 포집된 0.1 N H₂SO₄ 용액을 0.1 N NaOH로 pH 5.4가 될 때까지 적정하였다. 지시약은 methyl redmethylene blue 혼합지시약을 사용하였다.

9.Amylase 활성

효소활성에 필요한 조효소액은 시료 10 g에 증류수 90 mL 를 가하여 상온에서 200 rpm으로 30분 동안 stomacher (Seward Co., UK)로 진탕 한 후, 원심분리기(Vision Sci. Co., Korea) 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액을 취하여 조효소액으로 사용하였다. Amylase 활성은 DNS방법 으로 측정하였다(Miller 1959). 완충용액(0.2 M phosphate buffer pH 7.0)에 호화되어 있는 1% 가용성 전분용액 0.5 mL와 동일한 완충용액(0.2 M phosphate buffer pH 7.0) 0.4 mL를 섞어 반응온도에서 5분간 예열 시킨 후 조효소액 0.1 mL를 가하여 60°C에서 10분간 반응시켰다. 그리고 DNS 시약 3 mL를 넣고 5분간 중탕하여 발색시킨 후 분광광도계 (UV-2101, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 540 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 효소활성을 구하기 위해서 glucose 로 표준곡선을 작성해서 사용하였다. 효소활성은 1분 동안 1 μmol의 glucose를 생성하는 효소의 양을 1 unit로 정의하 였다.

11.Protease 활성

Protease 활성은 Anson 방법(Anson 1938)에 따라 측정하 였다. 0.6% casein을 0.2M phosphate buffer (pH 7.0)에 녹인 기질 5 mL에 조효소액 1 mL를 넣어 37°C water bath 에서 10분간 반응 시킨 후, 0.44M trichloroacetic acid (TCA) 5 mL를 가하여 반응을 정지 시켰다. 30분간 실온에 서 방치 시킨 다음, 여과(Whatman No. 2)한 여액 2 mL를 취하여 0.55 M Na₂CO₃ 용액 5 mL를 첨가 시킨 후 Folin 시약 1 mL를 첨가하여 30분간 발색시켜서 578 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 분해물의 tyrosine 양은 tyrosine 표준 곡선 을 이용하였고 효소활성은 1분 동안 1 μmol의 tyrosine을 생성하는 효소의 양을 1 unit으로 하였다.

11.점질물

시료 10 g과 증류수 80 mL를 sterilized bag (Huko FS Co., Korea)에 넣고 stomacher (Seward Co., UK)를 이용하 여 200 rpm으로 10분간 균질화시켰다. 균질액을 3,000 rpm 에서 20분간 원심분리(Vision Sci. Co., Korea)하고 상등액을 동결 건조시킨 후 중량을 측정하였다(Hwang et al. 2004).

12.DPPH free radical 소거능에 의한 항산화 효과

시료 10 g에 에탄올 100 mL를 가하여 37°C에서 24시간 진탕시키고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리(Vision Sci. Co., Korea)하고 상등액을 여과하여 시료액을 제조하였다. 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 소거능은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(Blois 1958). 0.4 mM 에탄올로 희석한 DPPH (Sigma, Germany)용액 1 mL에 시 료액 0.5 mL를 가하여 30분간 실온의 암소에서 방치 후 분 광광도계(UV-2101, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거능 은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율 (%)로 나타내었다.

13.렌틸콩 청국장의 관능평가

관능평가는 경희대학교 학생 40명을 관능요원으로 기호도 검사를 실시하였다. 각각의 균주(S1, S2, S3, S4)를 이용하여 48시간 발효시킨 렌틸콩 청국장을 사용하였다. 시료는 5 g씩 투명 플라스틱 용기에 담아 제공하였으며, 시료번호는 세자 리 난수표를 이용하여 표시하였다. 색도, 냄새, 구수한 맛, 단 맛, 점질물 정도, 전반적인 기호도를 7점 척도법(1=매우 싫 다, 7=매우 좋다)으로 평가하였다.

14.통계처리

모든 실험은 2회 반복 하였으며, 실험 결과 분석은 SAS (Statistical Analysis System) 9.3program (한국SAS소프트웨 어 유한회사)을 이용하여 통계 처리 하였다. 각 시료에 대한 값은 Mean±SD으로 표시하였으며 시료간의 유의성 검정은 one-way ANOVA로 분석하여 duncan’s multiple range test 로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

III.결과 및 고찰

1.Bacillus 생균수

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 Bacillus 생균수는 <Table 1>에서 보는 바와 같이 발효 0시간에 7.73~7.77 log CFU/g의 범위였으나 발효 48시간에 9.21~9.51 log CFU/g으 로 유의적인 증가하였고 발효 72시간에는 8.97~9.41 log CFU/g으로 감소하였다(p<0.001). 발효 48시간에 S4가 9.51 log CFU/g로 가장 높았고 S3는 9.40 log CFU/g이었고 S1 (9.22 log CFU/g), S2 (9.21 log CFU/g)가 낮게 나타났다 (p<0.01). Youn et al.(2002)의 Bacillus natto와 Bacillus subtilis를 이용한 청국장 발효에서 40시간 이후 생균수가 9 log CFU/g에 이른다는 연구결과와 유사하였다. Mann et al. (2013)의 Bacillus subtilis MC31을 이용하여 청국장을 제조 한 연구에서는 청국장 발효 24시간까지 대수 증식기를 보이 며, 그 이후로 정지기에 들어가 발효 36시간에 가장 높은 균 수를 나타내었고, 발효 60시간 이후 균수가 낮아졌다. Lee et al.(2015)의 Bacillus licheniformis로 발효시킨 렌틸콩 첨가에 따른 청국장 제조 연구에서는 렌틸콩 100%와 렌틸콩 50% 첨가군에서 생균수가 8 log CFU/g이상으로 나타났다.

2.pH

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 pH는 <Table 2>에서 보 는 바와 같이 발효 0시간의 pH는 6.69~6.74에서 발효 48시 간에 pH 7.60~7.92로 유의적으로 증가하였고(p<0.001), 발효 72시간에는 pH 7.55~7.87로 유의성이 나타나지 않았다. 72 시간 발효 시 pH는 S4 (7.87)가 S1 (7.66), S2 (7.55), S3 (7.68)보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 청국장의 발효가 진 행될수록 pH가 상승하는 것은 렌틸콩의 단백질이 아미노산 으로 분해되고 탈아미노화로 암모니아 생성에 기인된 것으 로 사료된다. pH는 청국장의 발효진행 상태를 확인하는 지 표로써 pH 7.5~8.0의 범위이면 발효가 잘된 상태라 볼 수 있는데(Song 2015), S1, S2, S3, S4 균주를 이용하여 발효 시킨 렌틸콩 청국장 모두가 48, 72시간 발효 시 pH 7.55~7.92로 발효가 잘된 상태라 할 수 있다. 우리나라 전통 청국장의 지역별 평균 pH는 7.21(5.89~7.95)이라고 보고되었 다(Ahn & Lee 2003). Park & Cho(2008)의 녹차 첨가 청 국장의 pH는 7.86~7.92로 나타내었으며, Jung et al.(2012) 의 대두를 발아시켜 제조한 청국장의 pH는 7.47~7.68로 본 실험결과와 유사하였다. 청국장의 pH는 발효가 진행됨에 따 라 증가하다가 최대 pH를 보인 이후 다시 감소하는 경향을 나타내는 것으로 보고하였다(Sung et al. 1984).

3.환원당

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간 동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 환원당 함량은 <Table 3>에서 보는 바와 같이 모든 균주에서 발효 48시간까지 증 가하였고 그 이후에는 감소하였다. 발효 0시간의 환원당 함 량은 0.20%에서 발효 24시간에 0.57~0.77%로 4균주 모두 약 3배 정도 유의적으로 증가하였고 발효 48시간에도 0.89~1.45%로 증가를 하였으나, 발효 72시간에 0.80~1.12% 로 감소하였다(p<0.001). 발효 48시간의 환원당 함량은 S3 (1.45%)이 S1 (0.89%), S2 (0.92%), S4 (0.95%)보다 높았 다(p<0.001). Lee et al.(2013)은 청국장 발효과정 중 콩의 전분은 Bacillus균주가 분비하는 효소의 작용으로 가수분해 되어 청국장의 단맛을 나타내는 당류가 생성된다고 하였다. 렌틸콩 청국장이 발효 48시간까지 환원당 함량이 증가하는 이유는 청국장의 발효가 시작되면서 발효균주의 생육에 따 른 amylase의 작용에 의한 것으로 사료되며, 발효 후기에는 발효균주의 증식에 필요한 영양원과 화학적인 반응의 기질 로 환원당을 이용하므로 함량이 감소하는 것으로 사료된다. Joo et al.(1989)은 전통장류 제조업체에서 수집한 장류 18점 의 환원당을 분석한 결과 0.51~1.24%로 보고하였다. Shon (1999)은 여러종류의 발효 균주를 첨가하여 청국장을 제조할 때 발효 24시간까지 환원당의 함량이 지속적으로 증가 후 감 소 하는 것으로 보고하였으나 본 실험에서는 48시간까지 증 가하였으므로 이는 Bacillus subtilis 균주의 amylase활성의 차이에 기인된 것으로 사료된다.

4.아미노태 질소

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 아미노태 질소는 <Table 4>에서 보는 바와 같이 72시간 발효하는 동안 모든 균주에 서 아미노태 질소함량은 증가하였다. 발효 0시간에는 51.80~ 64.40 mg%이었으나 발효 24시간에 120.40~193.20 mg%, 발효 48시간에 260.40~330.40 mg%, 발효 72시간에는 308~ 382.20 mg%로 증가하였다(p<0.001). 발효 48시간의 아미노 태 질소함량은 S3 (312.50 mg%)와 S4 (330.40 mg%)가 S1 (260.40 mg%)과 S2 (261.80 mg%)보다 높았고(p<0.05), 발 효 72시간에도 S3 (382.20 mg%)와 S4 (367.50 mg%)가 S1 (308 mg%)과 S2 (338.80 mg%)보다 높게 나타났다(p<0.01). 아미노태 질소함량은 protease의 활성에 의하여 단백질이 가 수분해되어 아미노산의 형태로 분해되는 정도를 나타내므로 렌틸콩 청국장의 구수한 맛, 감칠맛의 판단 지표로 사용될 수 있을 것이다. 그러므로 Bacillus subtilis S3와 S4로 발효 시킨 렌틸콩 청국장의 구수한 맛과 감칠 맛이 우수할 것으 로 사료된다. 현재 식품공전의 규격에는 청국장의 아미노태 질소함량을 280 mg% 이상으로 규정하고 있다. 렌틸콩 청국 장의 발효 48시간에 모든 균주의 아미노태 질소 함량이 식 품공전의 규격을 만족시켰으며, 균주에 따라 아미노태 질소 생성에 차이가 있음을 알 수 있었다.

Hwang et al.(2008)은 발효기간 중 protease가 대두 단백 질에 작용하여 아미노태 질소형태로 가수분해하여 구수한 맛 이 생성되며, 이는 청국장의 품질를 향상시키는 역할을 한다 고 하였다. 그러나 아미노태 질소가 생성됨과 동시에 불쾌취 를 형성하는 암모니아태 질소도 형성되므로 적절한 프로테 아제 활성 및 아미노태 질소 함량을 유지하는 것이 청국장 의 품질에 중요할 것이다.

5.암모니아태 질소

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 암모니아태 질소는 <Table 5>에서 보는 바와 같이 72시간 발효하는 동안 모든 균주에서 암모니아태 질소함량은 증가하였다(p<0.001). 발효 0시간에는 21.25~24.30 mg%이었으나 발효 24시간에 61.65~ 100.20 mg%, 발효 48시간에 151.05~188.75 mg%, 발효 72 시간에는 170.30~216.55 mg%로 증가하였다. 발효 48시간에 암모니아태 질소 함량은 S4 (188.75 mg%)가 가장 높았고 S3 (178.40 mg%), S2 (151.70 mg%), S1 (151.05 mg%)로 나타났다(p<0.001). 발효 72시간의 암모니아태 질소함량은 S3와 S4가 가장 높았고 S2, S1순으로 나타났다(p<0.001). Bacillus subtilis S3와 S4는 72시간 발효하는 동안 구수한 맛과 감칠 맛을 나타내는 아미노태 질소함량이 높았으나 부 패취의 원인이 되는 암모니아태 질소함량도 높은 것으로 나 타났다.

Woo et al.(2006)의 연구에서 Bacillus subtilis를 이용하여 제조한 청국장의 암모니아태 질소함량은 발효시간이 경과함 에 따라 증가하였으며 특히 발효 20시간 이후에 급격히 증 가하는 것으로 보고하였다. Lee et al.(1992)은 5균주를 이용 하여 청국장을 제조 하였는데, 발효 72시간에 140~230 mg%의 암모니아태 질소함량을 나타내 본 실험 결과인 170.30~216.55 mg%와 유사하였다. Sung et al.(1984)은 청 국장의 암모니아태 질소함량이 발효 12시간 이후 급격하게 증가하였으며, 발효시간이 경과함에 따라 꾸준한 증가로 발 효 72시간에는 400 mg%의 암모니아태 질소함량을 나타내 었다. 암모니아태 질소는 단백질 분해과정에서 deamination 에 의하여 생성되며 암모니아태 질소가 식품 내에 과량으로 축적되면 부패취로 작용한다. 청국장 발효과정 중 암모니아 태 질소의 증가는 발효과정 중 protease에 의하여 단백질이 수용성 질소로 분해된 후 peptide를 거쳐 아미노태 질소로 분해됨으로써 청국장의 구수한 맛을 생성함과 동시에 발효 가 계속 진행되면서 암모니아태 질소가 형성되어 불쾌취도 나타나는 것으로 보고하였다(Kim et al. 1982). 이러한 불쾌 취는 청국장의 품질을 저하시키는 원인이 되므로 아미노태 질소함량은 높고 암모니아태 질소함량은 낮은 청국장이 소 비자들의 기호에 적합할 것이다.

본 실험결과 모든 균주에서 72시간 발효하는 동안 아미노 태 질소, 암모니아태 질소 모두 유의적으로 높게 나타내었다 (p<0.001). 이는 아미노태 질소로 인한 구수한 맛, 암모니아 태 질소로 인한 불쾌취 모두 높다고 보여진다. 그러므로 렌 틸콩 청국장의 발효시간은 48시간이 적당할 것으로 사료된다.

6.Amylase 활성

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 amylase 활성은 <Table 6>에서 보는 바와 같이 발효 0시간에 0.48~0.58 unit/g에서 48시간에 3.05~4.22 unit/g로 모든 균주에서 증가하였으나, 발효 72시간에는 2.84~4.00 unit/g으로 감소하였다(p<0.001). 발효 48시간의 amylase 활성은 S3 (4.22 unit/g)가 높았고 S4 (3.50 unit/g), S2 (3.22 unit/g), S1 (3.05 unit/g)순으로 나타났다(p<0.001).

환원당 함량<Table 3>은 발효 48시간에 S3가 다른 균주들 보다 높게 나타났는데 이는 S3의 높은 amylase활성에 의한 것으로 추정된다. 높은 amylase 활성은 환원당 함량에 영향 을 주므로 청국장의 단맛에 기여한다고 볼 수 있다(Jiang 2007). 그러나 발효가 진행되면서 기질인 탄수화물이 감소하 고, amylase 생성능이 있는 균주의 생육 감소에 의하여 amylase 활성이 낮아지는 것으로 사료된다. Baek et al.(2014)의 콩 품종별로 발효시킨 청국장은 발효 48시간까 지 amylase 활성이 증가하여 본 실험 결과와 유사한 결과를 나타내었다.

7.Protease 활성

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 37°C에서 72 시간동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 protease 활성은 <Table 7>에서 보는 바와 같이 발효 0시간에 0.86~0.93 unit/g에서 발효 48시간에는 4.66~5.48 unit/g로 모든 균주에서 유의적으 로 증가하였고 72시간에는 4.80~5.63 unit/g으로 활성이 유지 되고 있었다(p<0.001). 발효 48시간의 protease 활성은 S3 (5.48 unit/g)와 S4 (5.41 unit/g)가 S1 (4.66 unit/g)과 S2 (4.79 unit/g)보다 높게 나타났다(p<0.001). Jung et al.(2012) 은 발효시간이 길어질수록 protease 활성이 증가한다고 하였 으며, 발효 초기에 protease 활성이 급격하게 증가하고 48시 간 이후에는 비슷한 활성 수준이 유지된다고 보고하였다.

8.점질물

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 72시간 동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 점질물 함량은 <Table 8>에서 보 는 바와 같이 발효 0시간에 0.23~0.34%에서 발효 48시간에 3.01~3.23%로 모든 균주에서 유의적으로 증가하였으나 72시 간에는 2.47~2.73%로 감소하였다(p<0.001). 발효 48시간의 점질물 함량은 발효 24시간에 비해 모든 균주에서 약 3배 정 도 증가하였으며, S2가 3.23%로 S1 (3.01%), S3 (3.02%), S4 (3.06%)보다 높게 나타났다(p<0.05). 점질물은 청국장의 발효 과정 중에 Bacillus subtilis에 의해 생성된 대사 물질로 구성되며, 탄수화물 분해물인 fructose 중합체인 fructane과 단백질 분해물 glutamic acid 중합체인 polyglutamate의 혼 합물로 보고 되었다(Lee et al. 1992). 점질물은 청국장의 품 질을 결정하는 중요 요인 중 한가지이다(Kim et al. 2006). Choi(2016)의 Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용한 대 두 청국장은 발효 48시간에 4.78~7.16%를 나타내었고 S1과 S2가 S3, S4보다 높게 나타내었다. 본 실험결과 발효 48시간 에 렌틸콩 청국장의 점질물은 3.01~3.23%로 대두 청국장보 다 낮은 함량을 보였으나, 두 청국장 모두 S2가 가장 높게 나타났다. Lee et al.(2005)의 Bacillus sp.를 이용하여 제조 한 대두 청국장에서는 발효 48시간에 점질물이 2.15~6.03% 함유되어 있다는 결과를 보고하였다.

9.DPPH free radical 소거능에 의한 항산화 효과

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4를 이용하여 72시간 동안 발효시킨 렌틸콩 청국장의 DPPH radical 소거능은 <Table 9>에서 보는 바와 같이 발효 0시간에 31.17~35.52%에서 발 효 48시간에 65.48~85.83%로 증가하였으나 발효 72시간에 는 63.21~68.76%로 유의적으로 감소하였다(p<0.001). 발효 48시간에 S1 (81.29%), S3 (83.83%), S4 (85.83%)가 S2 (65.48%)보다 DPPH 소거능이 높게 나타났다(p<0.01). Choi(2016)의 재래간장으로부터 분리한 Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4로 제조한 대두 청국장은 발효 48시간에 S4는 90.55%, S3는 88.29%, S1은 78.50%, S2은 73.34%순으로 항산화능을 나타내었으며, 본 실험에서도 48시간 S2로 발효 시킨 렌틸콩의 항산화 활성이 가장 낮게 나타났다. Kang et al.(2013)의 미역을 첨가한 청국장의 DPPH radical 소거능은 30.02~80.72%로 나타났으며, 발효 48시간까지 계속적인 증 가 후 발효 72시간에서 감소하는 경향을 보여 본 실험결과 와 유사하였다. 항산화 물질은 free radical에 전자나 수소를 공여하여 복합체를 만들고, DPPH는 항산화성 물질로부터 전 자, 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하므로 전 자공여능으로 부터 항산화 활성을 추정할 수 있다(Chung et al. 2002).

콩을 원료로 한 식품의 항산화 활성은 풍부한 isoflavones 함량에 의한 것으로 볼 수 있으며, 청국장 같이 발효 과정 중 생성된 폴리페놀, isoflavones, aglycone isoflavone의 생 성 및 증가가 항산화 활성을 증가시키는 것으로 보고하였다 (Kwak et al. 2007). 이외에도 콩 유래의 pheonlic acid와 당, 아미노산, 단백질 등이 발효 과정에서 maillard 반응으로 3-deoxyglucosone이 생성되어 free radical을 소거시키거나 phenolic acid와 금속이 결합하여 radical의 생성을 억제하는 것으로 보고하였다(Kweon et al. 2001; Natella et al. 1999).

10.렌틸콩 청국장의 관능검사

Bacillus subtilis S1, S2, S3, S4균주를 이용하여 37°C에 서 48시간 발효시킨 렌틸콩 청국장의 관능평가는 <Table 10>에 나타내었다. 40명의 패널에게 색도, 냄새, 구수한 맛, 단맛, 점질물 정도, 전반적 기호도를 7점 척도법으로 측정하 였다. 색도(color)에 대한 기호도는 S3 (5.20), S4 (4.95), S2 (4.68)가 S1 (3.00)보다 높았다(p<0.001). 냄새(smell)에 대한 기호도는 S3가 5.50으로 가장 높았고, S4는 4.95, S2는 4.73이었고 S1는 2.75로 낮게 나타났다(p<0.001). 구수한 맛 (savory taste)은 청국장의 특징으로 감칠맛이라 불리며, 렌틸 콩 청국장의 glycine, glutamic acid, arginine 함량이 영향을 줄 것이다. 구수한 맛은 S3 (5.18)와 S4 (5.10)가 가장 높았고 S2 (4.00), S1 (3.38) 순으로 나타났다(p<0.001). 단맛(sweet taste)에 대한 기호도도 S3 (4.95)와 S4 (4.75)가 가장 높았 고 S2 (4.05), S1 (3.05) 순으로 나타났다(p<0.001). 청국장 의 품질지표인 점질물에 대한 기호도는 S3 (4.88)와 S4 (4.73)가 가장 높았고 S2 (3.85)와 S1 (2.85) 순으로 나타났 다(p<0.001). 전반적인 기호도(overall acceptability)는 S3가 5.50으로 가장 높았으며, S4 (4.93), S2 (3.83), S1 (2.65) 순으로 나타났다(p<0.001). 관능검사의 결과 S3로 발효시킨 렌틸콩 청국장이 모든 기호도 측면에서 우수하였으며, S1으 로 발효시킨 렌틸콩 청국장은 색도, 냄새, 구수한맛, 단맛, 점 질물에 대한 기호도가 낮아 전반적인 기호도에 영향을 주었 을 것으로 사료된다.

IV.요약 및 결론

본 연구에서는 재래 간장에서 분리한 Bacillus subtilis 균 주들을 이용하여 발효시간을 달리한 렌틸콩 청국장을 제조 하고 품질 특성을 파악하여 최적의 발효시간과 우수한 균주 를 선별하고자 하였다. 렌틸콩 청국장의 Bacillus 생균수는 발효 0시간에 7.73~7.77 log CFU/g이었고 발효 48시간에 9.21~9.51 log CFU/g으로 유의적인 증가를 보였으나, 발효 72시간에는 8.97~9.41 log CFU/g으로 감소하였다. 렌틸콩 청국장의 pH는 발효 48시간에 유의적으로 증가하였고 S4 (7.92)가 S1 (7.72), S2 (7.60), S3 (7.67)보다 높게 나타났다. 렌틸콩 청국장의 환원당은 발효 48시간까지 0.89~1.45%로 증가를 하였고 발효 72시간에는 0.80~1.12%로 감소하였다. 렌틸콩 청국장의 아미노태 질소함량은 72시간 발효하는 동 안 모든 균주에서 증가하여 308.00~382.20 mg%로 나타났다. 72시간 발효하는 동안 모든 균주에서 암모니아태 질소함량 은 170.30~216.55 mg%로 증가하였다. 렌틸콩 청국장의 amylase 활성은 발효 48시간에 3.05~4.22 unit/g로 증가하였 으며, S3가 4.22 unit/g으로 S1 (3.05), S3 (3.22), S4 (3.50) 보다 높게 나타났으나 발효 72시간에는 감소하였다. 렌틸콩 청국장의 발효시간에 따른 protease 활성은 발효 48시간에 4.66~5.48 unit/g로 증가를 하였으나 72시간에는 4.80~5.63 unit/g으로 활성을 유지하였다. 렌틸콩 청국장의 점질물은 발 효 48시간에 3.01~3.23%로 증가를 하였으며, S2가 3.23%로 S1 (3.01), S3 (3.02), S4 (3.02)보다 높게 나타났다. 그러나 발효 72시간에는 2.47~2.73%로 감소하였다. 렌틸콩 청국장 의 DPPH 소거능은 발효 0시간에 31.17~35.52%이었고 발효 48시간에 65.48~85.83%로 유의적으로 증가를 하였으며, S4 (85.83), S3 (83.83), S1 (81.29)이 S2 (65.48)보다 높게 나 타났다. 그러나 발효 72시간에는 63.21~68.76%로 감소하였 다. 48시간 발효시킨 렌틸콩 청국장의 관능검사 결과 S3로 발효시킨 청국장의 색도, 냄새, 구수한 맛, 단맛, 점질물에 대 한 기호도가 높게 나타났으며 전반적인 기호도(overall acceptability)도 S3가 5.50으로 가장 높았으며, S4 (4.93), S2 (3.83), S1 (2.65) 순으로 나타났다.

이상의 연구 결과 48시간 발효시킨 렌틸콩 청국장이 Bacillus 생균수, 환원당, amylase 활성, 점질물, DPPH소거능 이 높게 나타났다. 발효 72시간의 렌틸콩 청국장은 protease 활성, 아미노태 질소 함량, 암모니아태 질소 함량이 높게 나 타났다. 구수한 맛을 나타내는 아미노태 질소 함량은 발효 48시간에 급증하여 식품공전의 규격을 만족시켰으며, 발효 72시간까지 완만한 증가를 나타내었다. 불쾌취 나타내는 암 모니아태는 발효 72시간까지 증가하였다. 렌틸콩 청국장의 아미노태 질소와 암모니아태 질소의 함량을 비교 시 발효 72 시간 보다 발효 48시간이 적절한 것으로 사료된다. 48시간 발효시킨 렌틸콩 청국장의 관능검사 결과 색도, 냄새, 구수 함 맛, 단맛, 점질물 정도, 전반적인 기호도에서 S3가 높은 기호도로 나타내어 렌틸콩 청국장 제조에 적당한 균주로 사 료된다. 렌틸콩을 발효시켰을 때 항산화능과 점질물이 증가 하는 것으로 나타났으며 렌틸콩 청국장은 가열하지 않고, Natto와 같이 청국장에 소스를 첨가하여 생으로 섭취하는 것 이 청국장의 영양성분을 보다 효율적으로 섭취할 수 있을 것 이다.