I.서 론
현대 사회는 대기오염, 공장폐수, 생활하수, 쓰레기 등의 과잉 발생으로 인한 환경오염이 날로 증가하고 있다. 특히 그 속에는 유기, 무기 독성물질이 함유되어 있어 인간이 유 용하게 쓰어야 할 식품, 물, 공기, 토양 등을 점차 오염시켜 인간의 생존을 위협할 뿐만 아니라 미량일지라도 여러경로 를 통해 장기간 동안 노출될 경우 생체내에 축적되어 대사 장애를 수반한다고 볼 수 있다(Kim et al. 1999). 이러한 유 해물질을 제거하고자 동물, 식물, 미생물, 고분자 합성물질을 이용하는 연구가 보고되었다(Choi et al. 1994; Kim et al. 1995). 알루미늄은 지구상에서 산소, 규소에 이어 3번째로 지 구 표면의 8%를 차지하는 금속으로 토양, 수질, 동, 식물체 등의 자연계에 널리 분포하며, 상수원수의 정수처리과정에도 광범위하게 사용되고 있다(Kim et al. 2002).
일상생활에서 알루미늄의 환경적 노출은 주로 물, 식품첨 가제, 음식, 알루미늄의 조리기구 및 용기에 의한 것으로 1 일 30~50 mg 정도 섭취되며(Bjorksten, 1982), 공기를 통해 서는 약 0.042 mg이, 물을 통해서는 약 0.26 mg의 알루미늄 이 매일 섭취된다고 한다(Sollars 1989). 고농도 알루미늄 노 출에 의한 질병으로는 골이형성증, 거대적 아구성빈혈, 위장 관장애, 심장독성, 간독성, 치매, 신경병증 등이 나타난다고 보고하였다(Cannata, 1991; Fulton & Jeffery 1992; Bouras et al. 1997; Swain & Chainy 1997; Schetinger et al. 1999; Berg et al 2000). 알루미늄으로 인한 질병이 발병하는 메카 니즘은 아직 명확하게 밝혀지지는 않았지만, 철이나 알루미 늄과 같은 금속이온들이 생체내에서 radical를 생성시켜 이들 이 지질과산화를 일으켜 만성질환을 일으키는 원인이 된다고 한다(Ohtawa et al. 1983; Frage et al. 1990; Takao 1993).
국민 소득과 생활수준의 향상으로 건강을 오래 유지하고 자 생리활성물질을 이용한 건강기능성 식품에 대한 수요가 증가하고 있는 가운데 약용작물로 재배되고 있는 구기자는 열매, 잎, 뿌리 등에 널리 이용되고 있다. 그 중 열매는 베타 인(betaine), 카로틴, 니코틴산, 비타민 A, B2, C 등이 함유되 어 있어 간보호, 피로 및 무력감 치료, 동맥경화 예방, 콜레 스테롤 감소 등에 효과가 있다고 한다(Cho et al. 2005). 특 히 구기자의 수용성 성분은 혈압강하효과와 메탄올 추출물 의 arachidonic acid에 의해 유발된 혈전 억제 효과 등이 있 다(Kim et al. 1994). 이외에 항암효과(Park et al. 2000), 면역증진효과(Park et al. 2002), 항비만 및 항당뇨효과 (Hwang et al. 2009), 항산화효과(Kim et al. 1995), 혈중콜 레스테롤 저하효과(Kim et al. 1998), 항고혈압효과(Lee et al. 1996; Cho et al. 2005; Lee et al. 2008)등에 관한 보 고가 있다. 현재 알루미늄이 인체에 미치는 유용성에 대해서 는 논란중으로 알루미늄이 사람들에게 지속적으로 노출되면 서 독성에 대한 연구가 계속 보고되고 있다(Gupta & Shukla 1995; Flaten et al 1996; EI-Maraghy et al. 2001). 특히 흡수된 알루미늄 대부분이 원위세뇨관을 통하여 소변 으로 배설되기 때문에 신장기능과도 매우 밀접한 관련이 있 다고 보고하였다(Krizek et al. 1997).
이에 본 연구에서는 고부가가치 생리기능이 있는 구기자 추출액이 알루미늄 중독완화에 어느 정도의 영향을 미치는 지를 보고자 고혈압 기전과 관계가 깊은 renin과 aldosterone 기능 및 혈액 중 AST, ALT, LDH 효소활성도와 신경전달물 질계통인 Choline acetyl transferase (ChAT) 활성에 대해 알아보고자 한다.
II.연구 내용 및 방법
1.추출물의 재료
본 실험에 사용된 구기자는 2013년산으로서 전북 구례시 장의 한약 재료상에서 구입하여 채취, 세척, 동결 건조하여 분쇄기(Daewoo grinder KMF-360, Korea)로 마쇄한 후 100 mesh로 분말화하였다. 3% 구기자 추출액은 분말화 한 30 g의 구기자를 1 L의 탈이온 증류수에 넣어 10시간 동안 밀봉 상태로 순환냉각기를 사용해서 60±10°C에서 가열한 후 여과하여 회전감압농축기로 농축시켜 구기자 추출액을 제조 하였으며 농축 정도는 3% 농도(고형분 함량비)의 시료용액 을 만들어 4°C에서 보관하여 시료로 사용하였다.
2.실험동물 사육
실험에 이용한 흰쥐는 Sprague-Dawley계(male, 100±10 g)로 일반 cage에 8마리씩 넣어 일반 고형사료(Purina Co, Seoul, Korea)로 1주일 동안 환경(온도 23±2°C, 습도 50~ 60%)에 적응시킨 다음 체중에 따른 난괴법으로 stainless steel cage에 한 마리씩 분리사육 하였고, 물과 식이는 제한 없이 먹도록 하였다. 각 군당 8마리씩 6개 군으로 <Table 1>에서 보는 바와 같이 정제수만을 급여한 대조군, 3% 구기 자 추출물군, 알루미늄 1000, 2000 ppm 단독 급여군, 3% 구기자 추출액에 각각 1000, 2000 ppm 알루미늄 병합 급여 군으로 나눈 다음 4주 동안 사육하였다.
흰쥐에 급여한 알루미늄 농도 기준은 알루미늄의 유해성 을 인식한 유럽공동체에서 먹는 물 중에 알루미늄 허용치를 0.05 mg/L로 규제하고 세계보건기구(WHO)에서는 알루미늄 허용치를 0.2 mg/L 이하, 우리나라는 먹는물 중 알루미늄의 규제농도를 0.2 mg/L 이하가 되도록 권장하고 있다(Choi 1995). 본 연구에서 Aluminum (Al2SO4)3의 공급은 일상생활 에서 식수를 통하여 오염될 가능성이 높다고 보는 중금속 농 도 음용수 수질 기준인 0.2 ppm을 중심으로 1000, 2000 ppm의 알루미늄을 함유하게 하였다(Han & Shin 2005). 실 험기간 동안 명암의 주기는 12시간 간격으로 조정하였고, 몸 무게는 1주일에 한 번 측정하였으며, 식이효율은 전 체중 증 가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 계산하였 다. 식이섭취량은 매일 정해진 시간에 측정하였으며 실험에 사용된 모든 기구는 무기질의 오염을 방지하기 위하여 0.5% EDTA (ethylenediaminetetra acetic acid)용액으로 세척한 후 탈이온 증류수로 헹구어 사용하였다.
3.시료 채취
실험 종료 후 휜쥐를 12시간 절식시킨 후 ethyl ether로 가볍게 마취한 후 개복한 즉시 심장 경동맥에서 10 mL 주사 기로 혈액을 채취하였고 각 장기는 간, 폐, 심장, 신장, 위 및 비장을 적출하여 무게를 측정하였다. 혈청은 15°C에서 20분 간 방치한 후 3000 rpm에서 15분간 원심분리하였고, 혈장은 채혈 즉시 항응고 처리된 관에 넣어 검사하였다.
4.각 조직의 알루미늄 함량 분석법
간, 폐, 심장, 신장, 위 및 비장을 –70°C에서 냉동보관 한 후 Ganje 습식분해법(Ganje & Page 1976)에 준하여 분석하 였다. 분석액은 방냉한 후 액을 50 mL로 정용한 다음 여과 하여 여과액을 ICPS (inductively coupled plasma spectrometer, Liberty 110-Varian)를 사용하여 <Table 2>의 조건으로 측정 하였다.
5.혈청중의 효소 활성도 측정
Asparatate amino transaminase (AST) 및 alanine amino transaminase (ALT) Reitman-Frankle법(Ginsberg; 1970)에 기초한 혈청 transamiase 측정용 Kit 시약(Asan pharm, Korea)을 사용하여 측정하였다. 정색시약(2.4-dinitrophenyl hydrazine) 1.0 mL를 넣어 실온에서 20분간 발색시킨 후 0.4 N-NaOH 10 mL 가하여 증류수 blank를 대조로 하여 spectrophotometer (Model Gilford ATASAR-3)로 505 nm에 서 비색정량하였다. AST, ALT의 활성 단위는 혈청 mL 당 Karmen unit로 하였다. Lactate dehydrogenase (LDH)는 Kit 시약(Mizuho, Medy, SR-1110, Japan)을 이용하여 spectrophotometer(Model Gilford STASAR-3)로 570 nm에 서 흡광도를 측정하였다. Choline acetyl transferase (ChAT) 는 Kit 시약(Roche, switzwerland)을 이용하여 분석기기 (Cobas Integra 800, Roche switzland)로 측정하였다.
6.혈장 renin과 aldosterone 활성도 측정
혈장 renin 활성도는 소량 (25 μL)의 혈장에 대량의 renin 기질을 사용하여 생성된 angiotensin I을 측정하는 방법으로 정량하였다(Cho et al. 1987) Angiotensin I의 항체는 Goodfriend et al.(1964)의 방법에 따라 angiotensin I (5-I le, 9-His)을 토끼의 혈청 albumin에 접합시켜 동량의 Freund’s adjuvant 와 잘섞어 6주간 1회씩 여러 부위에 주사하였다. 2주후부터 채혈하여 그 titer를 측정하였으며 혈장은 56°C에서 30분간 불활성화하여 측정하였다. Titer가 결정된 angiotensin I 항혈 청은 사용에 편리하도록 희석하여 소량씩 나누어 –70°C에 보관하였다. Renin기질은 Cho et al.(1979)의 방법에 따라 만들었으며 renin 활성도의 측정을 위한 angiotensin I의 측 정은 Sealey et al.(1973)의 방법을 변형한 Cho et al.(Cho & Kim. 1982; Cho et al. 1989)의 방법에 따랐다. 변환효소 및 angiotensinases의 억제제로는 EDTA, phenylmethyl sulfonylfluoride 및 8-hydroxy-quinoline을 사용하였다. Angiotensin I의 radiommunoassay는 boivine serum albumin을 포함한 Tris-acetate buffer (pH 7.4, 0.1M)를 사용하는 일반적인 방 법에 따랐다. 4°C 하에서 18~30시간 방치 후 charcoal suspension(activated Norit A charcoal, 6.0 g; dextran T 70, 0.625 g; phenylmercuric acetate 34 mg; Tris-acetate buffer (pH 7.4, 0.1M)으로 1 L 되게 하여 bound form과 free form을 분리하였으며 gamma counter (Autogamma 5500, Packard, Downers Grovn, IL, USA)를 사용하여 그 radioactivity를 측정하였다. 혈장 aldosterone 농도는 aldosterone solid-phase RIA kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angles, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
7.통계처리
실험 결과는 SPSS 프로그램을 이용하여, 각 실험군의 평 균과 표준편차를 구하였고 ANOVA Duncan’s multiple range test에 의해 p<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
III.결과 및 고찰
1.체중 증가량 및 식이 효율
알루미늄 용액과 3% 구기자 추출액의 급여에 따른 체중 증가량, 식이섭취량, 식이효율은 <Table 3>에서 보는 바와 같다. 식이섭취량에서 대조군은 20.18 g, 구기자 추출액 단독 급여군은 21.43 g으로 대조군과는 유의한 차이를 보이지 않 았다. 또한 알루미늄 단독급여군은 22.04~23.19 g, 구기자와 알루미늄 병합급여군은 21.02~22.25 g으로 알루미늄 단독급 여군에 비하여 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다. 체 중증가량에서 대조군은 73.47 g, 구기자 추출액 단독급여군 은 70.14 g, 농도를 달리한 알루미늄 단독급여군은 69.03~ 70.70 g, 구기자 추출액과 알루미늄의 병합급여군은 65.34~ 67.02 g으로 알루미늄 단독급여군에 비하여 약간 감소하였으 나 유의한 차이는 없었다. 식이효율은 각 실험군간에 유의적 인 차이는 나타나지 않았다.
2.각 조직중의 알루미늄 함량
간, 심장, 신장, 폐, 위 및 비장 조직 중의 알루미늄 함량에 서 대조군과 구기자 추출액 단독급여군 간에는 유의한 차이 를 보이지 않았으며 전체적으로 알루미늄 단독 급여군에 비 하여 알루미늄과 구기자 추출액 병합급여군의 함량은 감소 하였다.
<Table 4>에서 보는 바와 같이 각 조직에 있어서 대조군 은 0.76~2.66 mg/100 g, 구기자 추출액 단독급여군은 0.74~ 2.91 mg/100 g, 알루미늄 단독급여군은 1.04~5.07 mg/100 g에 비하여 구기자 추출액과 알루미늄 병합급여군이 0.84~3.91 mg/100 g으로 유의적으로 감소하였다. 일반적으로 체내에 중 금속이 축적되면 식욕감퇴, 체중감소, 면역능력 감소 등의 중 독 증상이 나타나며, 간이나 신장에 축적되기 쉽고, 일부 유 독성 금속은 비교적 낮은 농도에서도 체조직과 반응하여 서 서히 독성작용을 나타내어 일단 중독이 되면 완치가 불가능 하다는 보고도 있다(Chung et al. 1999; Choi et al. 2002). Moon et al.(2004)에 의하면 조직 내에 있어서 알루미늄 농 도 증가는 산화적 손상을 양적으로 증가시킨다고 보고하였 는데 본 결과에서 알루미늄 단독 급여군에 비하여 구기자와 알루미늄 병합급여군의 유의적인 감소는 구기자 추출액의 항 산화성 화합물 성분이 알루미늄 금속이온과 착염을 형성하 여 체내조직의 알루미늄 축적량을 어느 정도 감소시킨 것으 로 생각된다.
4.혈장 중 renin과 aldosterone 호르몬에 미치는 영향
알루미늄과 구기자 추출액을 급여한 흰쥐의 renin과 aldosterone 호르몬 농도는 <Table 5>에서 보는 바와 같다. Renin 호르몬 농도에서 대조군은 285.57 ngAl/mL/hr으로 구 기자 추출액 단독급여군은 143.10 ngAl/mL/hr으로 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 알루미늄 단독급여군은 322.78~350.10 ngAl/mL/hr, 알루미늄과 구기자 추출액 병합 급여군은 272.54~274.90 ngAl/mL/hr으로 알루미늄 단독급여 군에 비하여 유의적으로 감소하였다. Aldosterone 농도에서 대조군이 336.96 pg/mL, 구기자 추출액 단독급여군은 279. 09pg/mL으로 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 알루미 늄 단독급여군은 636.12~697.33 pg/mL, 알루미늄과 구기자 추출액 병합급여군은 535.68560.93 pg/mL으로 알루미늄 단 독급여군에 비하여 유의적으로 감소하였다.
혈관의 수축작용은 신장에서 분비되는 renin의 효소작용에 의해 생성된 고혈압에 의해 일어나며, angiotensin은 부신피 질에서 aldosterone 분비 증가를 일으키는 요인이 되므로 고 혈압의 발생기전은 renin-angiotensin-aldosterone system이 매우 중요한 역할을 한다고 보고하였다(Lee et al. 1996). 따 라서 이를 해결하고자 고혈압 치료제로서의 개발 가능성으 로 식물 잎에서 분리한 phenol성 물질에 대한 ACE (Angiotension converting enzyme)저해 활성이 보고되었다 (Pertrillo & Ondetti 1982; Wyvrett et al 1985). renin 호 르몬 생리 기능은 나트륨의 배설량을 감소시키고 교감신경 을 자극하여 angiotensin 생성에 영향을 끼치기 때문에 renin 활성도가 높으면 신장기능이 저하된다고 한다. 따라서 renin 과 aldosterone 농도에서 알루미늄 단독급여군에 비하여 구 기자 추출액과 알루미늄 병합급여군의 유의적인 감소는 구 기자의 성분 가운데 phenol성 화합물, betain, rutin, kukoamine A 등이 함유된 천연항산화제 성분의 영향(Cho et al. 2005) 으로 renin과 aldosterone 농도가 감소한 것으로 사료되나 이 에 대한 기전은 좀 더 많은 연구가 필요한 것으로 사료된다.
5.혈청 중 ALT, AST 활성도
혈청중의 ALT, AST 활성은 정상상태에서는 효소의 활성 이 낮으나 심장, 간, 근육, 혈구 등의 조직이 병적 상태에 빠 지거나 혹은 붕괴되어 질병이 발생하면 세포내에 존재하는 효소가 다량으로 혈중에 유출되어 활성이 증가하는 효소로 만성간염, 급성간염, 지방간, 알콜성간염, 간암 등 주로 간세 포의 변성이나 괴사를 반영한다(Bergmeyer 1995). 알루미늄 급여에 따른 구기자 추출액 급여가 ALT와 AST 활성에 영 향을 미치는지를 조사한 결과는 <Table 6>과 같다. AST는 대조군이 61.20 IU/L에 비하여 구기자 추출액 단독 급여군이 62.24 IU/L로 대조군과 유의한 차이가 없었다. 알루미늄 단 독급여군은 96.40~108.20 IU/L인데 비하여 알루미늄과 구기 자 추출액 병합급여군이 71.40~87.00 IU/L으로 알루미늄 단 독급여군에 비하여 유의적으로 감소하였다. ALT는 대조군이 236.43 IU/L, 구기자 추출액 단독급여군이 278.60 IU/L으로 대조군에 비하여 증가하였으나 유의한 차이는 없었다. 알루 미늄 급여군은 479.40~531.00 IU/L으로 구기자 추출액과 알 루미늄 병합급여군은 321.00~377.66 IU/L으로 알루미늄 단 독급여군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 구기자의 성분 가운데 betaine은 사염화탄소로 손상을 입은 간세포에 투여 한 결과 ALT 농도가 감소하였으며, 간의 해독작용에 관여하 는 glutathione-S-transferase의 활성도가 증가하여 간독성을 완화시킨다고 보고하였다(Kim et al. 1993).
즉, 구기자에 약 0.1% 정도를 차지하는 betain이 간을 보 호하는 기능이 있는 것으로 보아 알루미늄을 단독급여한 군 에 비하여 구기자 추출액과 알루미늄 병합급여군이 감소한 것은 구기자 추출액으로 인해 어느 정도 알루미늄 방어에 영 향을 미친 것으로 사료된다.
6.혈청 중 LDH, ChAT 활성도
LDH는 해당계 효소의 일종으로 간, 심장, 골격근에 분포 되어 있는 효소로 이 활성의 증가는 심장, 간, 신장질환, 암, 악성빈혈 및 백혈병 등에서 볼 수 있다(Rhee et al. 1989). LDH는 대조군이 1903.80 IU/L, 구기자 추출액 단독급여군 은 1993.40 IU/L으로 대조군에 비하여 약간 증가하였으나 유의한 차이는 없었다. 알루미늄 단독급여군은 3620.25~ 3526.40 IU/L으로 구기자 추출액 급여군과 알루미늄 병합급 여군은 2488.80~2956.40 IU/L으로 감소한 결과 알루미늄 단 독급여군이 다른 실험군에 비하여 LDH 활성도가 높았다. 이 는 중금속 이온을 투여한 실험군의 LDH 활성도 농도가 증 가하였다는 보고(Morgan et al. 1983; Yang et al. 1993)와 도 유사한 경향을 보였다.Table 7
Yang et al.(1993)에 의하면 세포막을 통과한 중금속 이온 들은 세포질과 세포소기관에 분포하는 ligand의 물질대사에 필수적인 미량원소와 경쟁적으로 결합하여 효소를 불활성화 시킬뿐만 아니라 이들 필수적인 미량원소의 정상적인 분포 에 영향을 주어 효소의 활성을 억제하여 대사 등의 생리적 기능을 저해한다고 한다.
따라서 알루미늄과 구기자 추출액 병합급여군이 알루미늄 단독급여군에 비하여 유의적으로 감소한 것은 구기자 추출 액 급여로 인해 어느 정도 알루미늄의 완화 효과를 볼 수 있 다고 사료된다. ChAT는 대조군이 340.20 IU/L, 구기자 추출 액 단독급여군이 397.60 IU/L으로 대조군에 비하여 증가하였 으나 유의한 차이가 없었다. 알루미늄 추출액 단독급여군은 316.20~322.80 IU/L, 구기자 추출액과 알루미늄 병합급여군 은 412.20~641.80 IU/L으로 알루미늄 단독급여군에 비하여 증가하였다. acetylcholine의 합성과 분해에 관련된 ChAT의 효소 활성은 체내 신경전달이 원활하게 이루어지기 위해서 중요하다(Schulz 2003; Oh et al. 2004). 따라서 알루미늄이 뇌조직에 축적되면 신경섬유가 변성을 일으켜 ChAT와 acetyl choline esterase의 활성도가 감소되며 알츠하이머 환자의 경 우 콜린성 기능 장애로 인해 ChAT의 활성도가 현저하게 저 하된다고 보고(Bowen 1983; Marquis & Black 1984)하였 다. 이와 같은 연구결과는 알루미늄이 감소된 ChAT 농도를 구기자 추출액의 급여로 인해 증가되어 뇌의 신경전달을 원 활하게 한 것으로 생각되어지나 추후 부가적인 연구가 계속 되어야 할 것으로 사료된다.
IV.요약 및 결론
본 연구는 구기자 추출액을 음용하였을 때 알루미늄 급여 에 따른 AST, ALT, LDH, ChAT 효소 활성도와 renin과 aldosterone 호르몬 농도에 대해 조사하였다.
알루미늄 용액과 구기자 추출액의 급여에 따른 식이섭취 량에서 구기자 추출액 단독 급여군은 대조군과는 유의한 차 이를 보이지 않았다. 알루미늄 병합급여군은 알루미늄 단독 급여군에 비하여 감소하였으나 각 실험군간에 유의성은 나 타나지 않았다. 체중 증가량에서 알루미늄 단독급여군은 구 기자 추출액과 알루미늄의 병합급여군에 비하여 약간 증가 하였다. 간, 심장, 신장, 폐, 위 및 비장 조직에서 대조군과 구기자 추출액 단독 급여군 간에는 유의한 차이를 보이지 않 았으며 알루미늄 급여군에 비하여 알루미늄과 구기자 추출 액 병합급여군의 함량은 감소하였다. Renin과 aldosterone 호 르몬 농도 및 AST와 ALT는 알루미늄 단독급여군에 비하여 알루미늄과 구기자 추출액 병합급여군이 유의적으로 감소하 였다. LDH는 구기자 급여군이 대조군에 비하여 약간 증가 하였으나 유의한 차이는 없었으며, 알루미늄 급여군에 비하 여 구기자 추출액과 알루미늄 병합급여군이 유의적으로 감 소하였다. ChAT는 알루미늄 단독급여군에 비하여 구기자 추 출액과 알루미늄 병합급여군의 농도가 증가하였다. 이와 같 은 결과는 구기자 다엽성분의 하나인 polyphenol계 화합물에 의한 항산화성 물질이 알루미늄과 착염을 형성한 것으로 장 기적인 구기자의 음용은 어느 정도 알루미늄에 의한 중독 완 화효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.